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1、生物 选修3现代生物科技专题,目 录,专题1 基因工程 专题2 细胞工程 专题3 胚胎工程 专题4 生物技术的安全性和伦理问题 专题5 生态工程,专题1 基因工程,基础理论和技术的发展催生了基因工程,20世纪中叶，基础理论取得了重大突破 1.DNA是遗传物质的证明 2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立 3.遗传密码的破译,技术发明使基因工程的实施成为可能 1.基因转移载体的发现 2.工具酶的发现 3.DNA合成和测序技术的发明 4.DNA体外重组的实现 5.重组DNA表达实验的成功 6.第一例转基因动物问世 7.PCR技术的发明,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通
2、过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的生物类型和生物产品。,一、基因工程的概念,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,定向地改造生物的性状，获得人类所需要的品种。,剪切, 拼接, 导入, 表达,基因重组,基本工具： 限制性核酸内切酶“分子手术刀” DNA连接酶“分子缝合针” 基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,二、 DNA重组技术的基本工具,黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的 核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,
3、1、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。,4000种。,（1）来源：,（2）种类：,（3）作用：,（4）结果：,形成两种末端,1、限制性核酸内切酶“分子手术刀”（小结）,要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶
4、来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端。,是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成 重组的DNA分子了?,实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。,思考题：,1、种类： 2、作用部位：,磷酸二酯键,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,2、 DNA连接酶“分子缝合针”,3、基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,（1）运载体的作用,作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。 利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。（随载体的复制而复制）,（2）作为运载
5、体必须具备的条件,能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。 具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 具有某些标记基因，便于进行筛选。 必需是安全的，不会对受体 细胞有害。 大小应适合，便于提取和操作,（3）常用的运载体,3、基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,细菌细胞质的质粒 噬菌体的衍生物 动植物病毒,注意：真正用作运载体的质粒都 是人工改造过的。,质粒：,质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的DNA分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的DNA分子。 质粒是基因工程最常用的运载体。 绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA
6、分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。,3、基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒， 其中常含有抗药基因，如四环素的 标记基因。质粒的存在与否对宿主 细胞生存没有决定性作用，但复制 只能在宿主细胞内成。,质粒是一种裸露的、结构简单、独 立于细菌染色体（即拟核DNA）之外， 并且具有自我复制能力的双链环状 DNA分子。,质粒是基因工程最常用的运载体。,（补充知识）基因的结构 1、原核细胞的基因结构,与RNA聚合酶结合位点,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板
7、合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,2、真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。,启动子与起始密码,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,二、基因工程基本操作的四个步骤,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,（一）目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,人们所需要的特定基因,2、获
8、取目的基因的常用方法,未知序列,（1）从基因文库中获取目的基因：,基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library) 基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库. 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)比较, 概念：PCR全称为_，是在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、 _、_ 、 _ 等 前提条件： 。,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结
9、果：,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,(2)利用PCR技术扩增目的基因,双链的解开,过程：,a、DNA变性（90-95）： 双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-60）： 系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）： 在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,（3）人工合成,反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，
10、然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,杂交双链 (单链RNA/单链DNA),单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA (目的基因),（3）人工合成,根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。,二、基因表达载体
11、的构建, 核心,3.将切下的目的基因片段插入 质粒的_处，再加入适量 _，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,4.一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有、以及等。,启动子,终止子,标记基因,质粒,DNA分子,DNA连接酶,4.过程:,（二）基因表达载体的构建, 核心,5.基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,（二）基因表达载体的构建, 核心,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质,终止子：位于
12、基因的尾端的一段特殊 的DNA片断，能终止mRNA的转录,标记基因的作用是为了鉴别受体细胞 中是否含有目的基因，从而将有目的 基因的细胞筛选出来,(三)将目的基因导入受体细胞,转化 ,方法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,(三)将目的基因导入受体细胞,农杆菌介绍: Ti质粒上有T-DNA, 称为可转移的DNA, 它可转移到受体细 胞,并整合到受体细 胞染色体DNA上.,2、将目的基因导入动物细胞(受精卵) 显微注射法 -世界上第一例“超级小鼠”的成功 设备:显微注射仪,3、将目的基因导入微生物细胞,(三)将目的基因导入受体细胞,
13、过程：,用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞. 是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在 一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程. 目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,通过目的基因上的标记基因，进行筛选和检测,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,所以要对受体细胞作怎样的处理？,对受体细胞中是否导入了目的基因
14、进行检测,怎样进行检测？,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,过程:A.首先取出转基因生物的基因组DNA B.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记, 以此做探针 C.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交
15、带, 表明染色体已插入染色体DNA中,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂 交带,表明目的基因转录出了mRNA.,为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,普通棉花抗虫棉,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,1、从基因文库中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因 3、化学方法人工合成,复制原点 + 目
