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1、临床免疫学检验,1,器官移植与HLA分型检测技术,2,major histocompatibility complex, MHC,主要组织相容性复合体,人类白细胞抗原,human leukocyte antigen, HLA,/ HLA复合体,/ MHC分子,/ MHC抗原,3,HLA的结构,HLA-类分子,HLA-类分子,4,公元4世纪罗马教堂,5,自体移植,同种同基因移植,同种异基因移植,异种移植,移植物抗原刺激受者的免疫系统/受者组织抗原刺激移植物中的免疫细胞诱发的免疫应答称为移植排斥反应,同种异型移植排斥反应,6,第1节 MHC基因和遗传特点（复习）,MHC基因的构成 MHC基因的特性
2、 MHC基因的意义,7,一、MHC基因的构成,（一）定位 第6号染色体短臂（6p21.31） 全长3600kb，共有224个基因座位，128个表达产物。 （二）基因区 经典类基因：B、C、A位点 经典类基因 ：DP、DQ、DR位点,8,类基因区,HLA复合体 3600kb长度 224基因座位,类基因区,A C B,DR DQ DP,MHC-类分子,MHC-类分子,9,10,二、MHC基因遗传特点,（一）HLA为高度多态性基因 MHC基因复合体是由多个位置相邻的基因座位组成，可以编码相同或相似的MHC抗原。,11,MHC为共显性表达,12,13,人群之中所有基因座位等位基因都相同的几率： 126
3、238124559385127650611019,人群之中MHC抗原相同的几率： 69246210281109,14,（二）单体型和连锁不平衡性,意义：器官移植选择供体顺序,自身同卵双生兄弟姐妹父母亲属无关人群,父母与子女完全相同的几率： 父母与子女一半相同的几率： 子女间完全相同的几率： 子女间一半相同的几率： 子女间完全不同的几率：,0 100% 25% 50% 25%,1.单体型遗传,15,1.单体型遗传,（二）单体型和连锁不平衡性,2.连锁不平衡性,（一）HLA为高度多态性基因,16,第2节 HLA与器官移植,17,在三类HLA分子中，、类分子是触发移植排斥反应的首要抗原。,次要组织相
4、容性抗原 ABO血型抗原系统 其他组织特异性抗原,主要组织相容性抗原,决定移植“成败”的抗原,18,一、器官移植的类型 （1）自体移植（autograft） 皮肤，骨髓，软骨和骨 （2）同种同基因移植（syngraft） （3）同种异基因移植（allograft） 同种异型移植 （4）异种移植（xenograft）,19,一、同种异型排斥反应的识别机制 受者对T细胞对供者的MHC分子的直接与间接识别。 （一）直接识别机制：,20,直接识别,受者T细胞,21,受者T细胞直接识别的靶结构,22,同种异型抗原的直接识别及其效应,23,（二）间接识别 受者T细胞识别受者APC加工处理的供者的MHC分子
5、 在急性排斥反应中、晚期以及慢性排斥反应中起重要作用。,24,识别方式,间接识别,25,同种异型抗原的间接识别,26,27,二、 同种异型移植排斥反应的类型及效应机制,（一）宿主抗移植物反应 （host versus graft reaction,HVGR） 依据反应发生的时间及病理强度分为： 1、超急性排斥反应（术后开始至几个小时） 2、急性排斥反应（术后几天至几周） 3、慢性排斥反应（术后数月至数年）,28,超急性排斥反应发生示意图,29,（二）移植物抗宿主反应 （ graft versus host reaction,GVHR ） 更为严重的一种排斥反应 原因： （1）受者与供者HLA不
6、相匹配； （2）移植物中成熟的T细胞多； （3）受者处于免疫功能极度低下的状态 常见于：骨髓移植（造血干细胞移植）、胸腺、脾移植及新生儿接受大量输血。,30,三、同种异体移植排斥反应的防治,（一）寻求与受者MHC相配的供者组织或器官 是目前最为有效多见的方法。 1、ABO血型抗原配型 2、HLA抗原配型 供者与受者HLA-A、B相配的位点越多存活率越高； 上述的基础上，HLA-DR、DQ尽可能的匹配； HLA-DR类型对存活率影响较大。,31,（二）使用免疫抑制药物 1、多为抑制T细胞药物 环孢菌素A（CsA）， FK-506、Rapamycin 2、去氧精胍菌素等抗生素类；阻断T细胞的生长周
7、期 3、激素 4、可溶性CK受体、抗CK抗体和抗粘附分子抗体,32,阻断协同刺激信号诱导T细胞失能,33,（三）诱导对移植抗原的特异性耐受 免疫抑制剂的毒副作用（致死性感染和肿瘤） 理想方法是诱导特异性耐受。新方案： 诱导凋亡； 诱导T细胞无应答（anergy）包括输入可溶性CTLA-4及CD40L-CD40、CD2-CD58等信息传递阻断。,34,第3节 HLA分型检测技术,分子生物学分型,血清学分型技术,细胞分型技术,20世纪60 年代,20世纪80 年代,20世纪70 年代,35,一、血清学分型技术,1.原理,应用一系列已知HLA特异性的分型血清与待测的淋巴细胞反应，通过补体依赖的细胞毒
8、性实验，来检测HLA抗原特异性。,典型技术：定型板法（微量细胞毒实验）,36,反应,结果测定,1.染料拒染法,台盼蓝,伊红,碘化丙啶 7-AAD,2.流式细胞术,37,染料拒染法的判定标准,38,39,2.血清学分型可检测的抗原 （SD 抗原）,HLA-类分子:,HLA-类分子:,B, C , A,DR, DQ （B细胞为靶细胞）,40,3.方法学评价,操作简便易行 节约试剂、结果可靠、重复性好 无需特殊设备,耗时长 不同批号抗血清结果常有不同,优点,缺点,41,二、细胞学分型技术（LD 抗原）,1.原理,混合淋巴细胞培养，检测细胞增殖 （mixed lymphocyte culture,ML
9、C）,单向MLC 双向MLC,42,阴性分型法,阳性分型法,1. 单向MLC,刺激细胞：已知HLA型别的分型细胞 （预处理，使其失去增殖能力） 反应细胞：受检者外周血单个核细胞 （具有增殖能力）,淋巴细胞转化（形态学） 3H-TdR 掺入法 MTT还原法,43,（1）阴性分型法,刺激细胞,HLA-DP1,受者T淋巴细胞,+,增殖弱 HLA-DP1,非HLA-DP1 增殖强,纯合子细胞 只表达HLA-DP1,照射处理,44,（2）阳性分型法,预致T敏细胞,非HLA-DP1,待测B淋巴细胞,+,增殖弱 非HLA-DP1,HLA-DP1 增殖强,刺激细胞 HLA-DP1,除DP抗原外，其他 HLA
10、抗原相同,照射处理,45,2. 双向MLC,遗传型不同的两个个体淋巴细胞在体外混合培养时，由于两者HLA不同，能相互刺激导致对方淋巴细胞增殖，故称双向MLC。,方法学评价： 不能分型，但可全面地反应供-受双方组织相容性。,46,三、分子生物学分型技术,(一）基本技术,1.限制性片断长度多态性分析 （restriction fragment length polymorphism, RFLP）,2.PCR/SSP 3.PCR-SSCP分型法,4.序列特异性寡核苷酸-聚合酶链反应 （PCR-sequence specific oligonucleotide, PCR-SSO）,5.基于序列的HLA
11、分型法 （sequence-based HLA typing,SBT）,47,芯片技术,原理：PCR-SSO反向斑点或印渍法的微型化。,(二）集成技术,48,（三）PCR-SSCP分型法,原理：对ssDNA进行无变性剂的聚丙烯酰凝胶电泳，序列的差异可形成不同的空间构象而导致电泳迁移率的差异，如此可分辨出单一碱基的差异和检测出DNA多态性或点突变。,（单链非变性电泳迁移分析）,49,病例介绍,一例链球群感染后肾炎、肾衰竭后肾脏移植。,男，14岁。首诊前3个月，感冒发烧病史。 首次就诊原因:头痛，乏力，眼睑浮肿。实验室检查：蛋白尿，尿红细胞阳性。抗炎症治疗1周，稍好，恢复上学，正常饮食。 2月后，
12、恶心、乏力，眼睑浮肿加重，24小时尿量减少，蛋白管型。 住院治疗2个月，肾脏衰竭加重，每周透析3到4次。 活检见肾小球内CIC沉淀，抗人IgA、IgG阳性。 建议：申请肾移植手术。亲属自愿做HLA配型，同时申请自无关人群寻找供体肾。,50,半年后分配到合适供体肾（无关人群）；检查身体，符合手术要求，进行肾脏移植手术。 术后临床观察并服用移植排斥抑制药物，补充EPO。 定期到医院检测血药浓度，检测免疫功能。 （移植后8年后生存状态良好，但长期服用抗移植排斥药物。,病例介绍,一例链球群感染后肾炎、肾衰竭后肾脏移植。,51,肾脏移植前选择供者的检查项目： 传染性疾病病原学检查 ABO血型配型 HLA
13、配型符合要求 供受双方淋巴细胞混合培养阴性 肾源选择的原则： 以ABO血型完全相同者为好，选择最佳HLA配型的供者器官，供者无传染性疾病。,52,移植后的临床观测: 1.T细胞总数、CD4/CD8比值、IL-2及其受体的检测，判断排斥反应的发生和评估免疫抑制剂治疗效果； 2.必要时做肾组织活检； 3.血药浓度检测，指导合理用药，减肝、脏肾毒性和免疫抑制。,53,1.ABO血型抗原一致,2.HLA配型 主要做HLA-DR、A、B 3.混合淋巴细胞反应：阴性 4.受者血清细胞毒性实验：阴性 受者血清+供者细胞,移植前免疫学检测,54,HLA匹配与移植排斥反应,存活率,55,3位点6个基因均匹配时，
14、移植肾的10年存活率为62%，5基因为47%，4基因为45%，3基因为40%，无1匹配时为33%，说明HLA配型可减少移植物的同种异型抗原性，有助于提高移植物的长期存活率,HLA-A、B、DR配型与肾移植术后10年存活率,6基因 5基因 4基因 3基因 无匹配,56,在三类HLA分子中，、类分子是触发移植排斥反应的首要抗原。,次要组织相容性抗原 ABO血型抗原系统 其他组织特异性抗原,主要组织相容性抗原,决定移植“成败”的抗原,57,思 考 题,按器官来源，器官移植可分为哪些类型？ 2.同种异性排斥反应的抗原有哪些？ 3.移植排斥反应中宿主T细胞识别MHC和抗原的方式有哪两类？简要描述其机制。 4.何为SD抗原？何为LD抗原？ 5.何为混合淋巴细胞反应？ 6.以同种异型肾移植为例，说明移植前需要做哪些免疫学检查，可采用的免疫学技术。HLA配型的情况与患者预后有何联系？移植手术后，患者还要采用哪些措施来控制排斥反应？,58,
