《多肽合成与生物活性肽课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《多肽合成与生物活性肽课件（68页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、多肽合成与生物活性肽,一、多肽与多肽合成,氨基酸,甘氨酸（Gly、G）、丙氨酸（Ala、A）、苯丙氨酸（Phe、F）、谷氨酰胺（Gln、Q）、天冬酰胺（Asn、N）、缬氨酸（Val、V）、亮氨酸（Leu、L）、异亮氨酸（Ile、I）、脯氨酸（Pro、P）、甲硫氨酸（Met、M）、半胱氨酸（Cys、C，巯基）、丝氨酸（Ser、S，羟基）、苏氨酸（Thr、T，羟基）酪氨酸（Tyr、Y，酚羟基） 、色氨酸（Trp、W，吲哚基）、谷氨酸（Glu、E，羧基）、天冬氨酸（Asp、D、羧基）、赖氨酸（Lys、K，氨基）、精氨酸（Arg、R，氨基）、组氨酸（His、H，胺基）,多肽（蛋白质）,氨基酸“首尾”以
2、酰胺键相连，相连的氨基酸数较少时称多肽，较多时称蛋白质。,多肽、蛋白质,人工合成胰岛素 1965年，我国上海生化所、上海有机所和北京大学的科学家经过6年多的努力，在世界上首次人工合成具有生命活力的蛋白质牛胰岛素。 （1953年合成八肽催产素，获得了1955年诺贝尔化学奖。） 胰岛素由A、B两个肽链组成， A链有21个氨基酸，B链有个30个氨基酸， A链和B链间由三个二硫键连接起来。,上面的氨基酸缩合脱水形成肽的反应式在生物体内的多肽、蛋白质的合成是成立的，但在人工合成多肽时，这一反应式是不能实现的。,液相法合成多肽,固相多肽合成方法 Merrifield在1962年开创了固相多肽合成法，并于1
3、984年获得诺贝尔化学奖。 固相多肽合成法的原理：用交联聚合物树脂作为载体，肽的合成在交联聚合物树脂内进行（共价固载于载体上）。交联聚合物树脂在任何溶剂中都不能溶解，但在某些溶剂中可溶胀，这样反应物、催化剂等可扩散到树脂内部参与反应。每一步反应结束后，通过简单的过滤、洗涤，即可将剩余的反应物、催化剂、副产物等去掉，然后进行下一步反应。最后将合成的肽从树脂上裂解下来。,聚合,功能基基化,固相合成,固相合成的优点,可以用过量的反应试剂使反应完全。 每步的产物都固定于不溶于任何溶剂的固相载体上，因此所需产物与其它过量试剂、催化剂等小分子试剂的分离可通过简单的过滤而实现。 在裂解前的所有操作步骤中，固
4、相载体始终处于同一容器中，没有任何机械损失。 可以用大过量的反应试剂及催化剂，使每一步反应趋于完全，提高产率，使最后的产物的纯化更加容易。 没有液相法中遇到的当肽链较长时不易找到合适的溶剂的问题。 容易实现自动化。现已有自动化程度很高的自动多肽合成仪。,二、生物活性肽,生物活性肽在生命活动中起着非常重要的作用，如胰岛素、生长激素、促肾上腺皮质激素、催产素等。 许多天然活性肽或天然活性肽的类似物也是非常重要的药物，多肽作为药物具有如下优点。,高效、专一，用量少 如鲑鱼降钙素剂量为 20g/支（50000支/g) 结构多变，随着各种生物技术和计算机模拟技术的发展，可得到具有各种功能的多肽药物 如在
5、计算机模拟的基础上，设计合成了治疗艾滋病的多肽药物T-20。FDA已批准200多种多肽和蛋白质药物的临床应用。 代谢产物为无毒的氨基酸,抗菌素的耐药性 抗菌素的使用挽救了无数的生命，使人的预期寿命增加了十年以上。但随着抗菌素的使用，细菌也逐渐对其产生了耐药性。一个新药研制的平均周期是约10年，而一个新抗菌素临床使用后细菌对其产生耐药性的平均时间为约2年。 一些超级细菌对目前使用的所有抗菌素包括被称为抗菌最后防线的万古霉素具有耐药性。细菌感染住院的患者中约7% 由于耐药细菌感染而死亡。,阳离子抗菌肽,抗菌素的种类,-内酰胺类 大环内酯类 喹诺酮 四环素类 氨基糖苷类 磺胺类,耐药机理,1. 细菌
6、变异细胞壁上抗菌素的结合部位，使抗菌素 失去与细胞壁的结合能力。 如万古霉素与细菌细胞壁粘肽末端的-D-Ala-D-Ala结合，从而抑制细菌的某些生理功能，起到抑菌作用。,抗万古霉素的细菌则把-D-Ala-D-Ala变异成-D-Ala-D-Lac，使万古霉素对其失去结合力而不起作用,2. 通过分泌-内酰胺酶而破坏化学上很不稳定的-内酰胺类抗菌素的-内酰胺环。 3. 分泌某种酶修饰抗菌素上的某些基团如乙酰化羟基等。,阳离子抗菌肽,1981年Boman等人从西哥罗佩蛾（Moth Hyalophora cecropia）体中分离得到抗菌多肽天蚕素（cecropin）（Nature，1981，292，
7、246）。 抗菌肽广泛存在于动植物体内，用来对付细菌、病毒和真菌等，已发现的抗菌肽已超过1000种。 抗菌肽中都含有较多的碱性氨基酸，在生理条件下带净正电荷，因此也叫阳离子抗菌肽。,抗菌肽的阳离子部分与细菌的细胞膜（阴离子性磷脂膜）的磷酸基负离子结合（静电作用），多肽的疏水部分与细胞膜的碳氢链结合（疏水作用），从而起到抑菌作用。,抗菌机理,抗菌肽不易产生耐药性的原因 由于阳离子多肽与细菌细胞膜的结合的特异性不高，细菌不易通过简单的变异或修饰多肽产生耐药性。抗菌肽的副作用 大部分抗菌肽除具有抗菌活性外，对哺乳动物细胞也有毒性，如溶血活性。 抗菌肽的抗菌活性和溶血活性都由多肽的两亲性引起，但一些抗
8、菌肽具有溶血活性，而另一些抗菌肽没有溶血活性的现象不能达到满意的解释。,* BC, blood cell; H, haemolymph; E, epithelial tissue. M. Zasloff, Nature, 2002, 415, 389-395,Table Commercial development of antimicrobial peptides of animal origin Mode of use Peptide Company Application Stage Totical MSI-78 Genaeral Infected diabetic Completed
9、Phase III; not foot ulcers approved by FDA, pend- ing additional studies Totical MBI-226 Micrologix Catheter infection Phase III Totical MBI-594 Micrologix Acne Phase II Oral IB-367 Introbiotics Mucostis Phase III Oral P-113 Demegen Gingivitis Phase II Systemic Heliomycin Entomed Antifungal Preclini
10、cal Systemic Human AM Pharm Antibacterial Preclinical lavotoferricin Systemic BPI Xoma Meningococcal Phase III meningitis M. Zasloff, Nature, 2002, 415, 389-395,目前的研究热点,抗菌机理、溶血机理 提高抗菌活性，抗菌活性不够高，因而用量较大 减小链长，肽链较长时合成成本高，且免疫源性高 较少溶血副作用,GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2 Melittin 的氨基酸序列,蜂毒肽(melittin)类似物,我们的研
11、究发现，蜂毒肽1226残基片断基本保留抗菌活性，但溶血活性基本消失。,蜂毒肽由26个氨基酸组成，具有很强的抗菌活性，同时还具有很强的溶血副作用。,Melittin的短缺肽及其类似物抗菌和溶血活性,以M(12-26)为模板，逐个改变1-9位的疏水性GLPALISWIKRKRQQ-NH2,结果： 右侧氨基酸的疏水性增加，则其抗菌活性显著的增加；左侧氨基酸的疏水性增加，则其抗菌活性略有增加。 右侧氨基酸的疏水性增加，则其溶血活性减小；左侧氨基酸的疏水性增加，则其溶血活性增加。,三、聚合物修饰多肽、蛋白质药物,多肽、蛋白质药物的缺点 口服生物利用率低 消化系统各种蛋白水解酶的降解作用 保存寿命短 血液
12、半衰期短 血液及各器官中蛋白水解酶的降解作用、肾过滤清楚作用 具有免疫原性 不易穿透生物膜,聚乙二醇，poly(ethylene glycol) (PEG)，poly(ethylene oxide) (PEO)：,特性： 两亲性，既亲水又亲油，可溶于水和许多有机溶剂如卤代烃，链高度柔顺。 无毒，可静脉注射、口服和外用 高生物相容性，是已知聚合物中对蛋白质的吸附作用最小的聚合物。表面用PEG修饰可减小对蛋白质吸附，进而降低被RES的俘获和免疫反应。,多肽、蛋白质药物用PEG修饰,Main advantages of PEGylated protein.,Approved PEG conjugat
13、es,Approved PEG conjugates (continued),PEG修饰多肽、蛋白质药物的作用 柔顺的PEG链及其结合的水分子对多肽、蛋白质起到保护作用，减小蛋白酶对其的降解作用。 PEG修饰使其分子量增大，减小肾过滤的清除作用。 PEG的保护作用减小其免疫原性。 PEG化后在更宽的pH和温度范围内更稳定。 使多肽、蛋白质药物 具有更高的疗效 显著延长其血液半衰期 副作用小 保存时间长,PEG分子量、支化对修饰多肽、蛋白质药物的影响 PEG分子量愈大，则对多肽、蛋白质的保护作用愈大，血液半衰期愈长，免疫原性愈小。 支化的PEG对多肽、蛋白质的保护作用比直链PEG的大。 PEG化
14、往往使多肽、蛋白质的体外生物活性降低。 PEG分子量愈大，体外生物活性降低降低得愈多。,PEG分子量的大小对多肽、蛋白质的保护作用的影响和对其体外生物活性的影响是相互矛盾的。,Interferon -2a的PEG化,Reaction mechanism of the synthesis of PEG2-IFN.,P. Bailon, et al., Bioconjugate Chem., 2001, 12, 195-202,In Vitro Antiviral Activities of Interferon -2a and PEG2-IFN,Interferon -2a PEG化后其血清半衰
15、期增加了70倍。,In vivo antitumor activity of interferon -2a (top panel) and PEG2-IFN (bottom panel),Growth hormone-releasing factor (GRF) 的PEG化,如果多肽中含有多个氨基，PEG化往往得到混合物。,P. Espositoa, et al., Adv. Drug Delivery Rev. 2003, 55, 12791291,Primary amino acid sequence of GRF,In vitro biological activity of the t
16、wo isomers composition GRF1PEG5000 and of the two single mono-PEGylated isomers,Biological stability in human pooled plasma,抗菌肽的PEG化 Nisin用5000kDa的PEG修饰后抗菌活性完全丧失。,A. Guiotto, et al., Il Farmaco 2003, 58, 45-50,tachyplesin用5000kDa的PEG修饰,Y. Imura, et al., Biochim. Biophys. Acta 2007, 1768, 11601169,PEG分子量、支化对修饰多肽、蛋白质药物的影响 PEG分子量愈大，
