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1、第四节 基因的分离和获得,中国药科大学 生物制药教研室,目标基因克隆的三大战略： 1.利用PCR技术或化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆、表达； 2.构建感兴趣的生物个体的基因组文库或cDNA文库； 3.利用基因差异表达获得目的基因。,基因的分离和获得的常用方法,一、基因分离的物理方法 二、鸟枪法(Shot gun) 又称霰弹法 三、cDNA文库的建立与基因的分离 四、基因组文库法 五、基因的化学合成 六、聚合酶链反应技术（PCR）,一、基因分离的物理方法 根据DNA分子的两条链存在着GC，A=T碱基配对。 如DNA分子中某段的GC碱基对含量高，则其热稳定性就高，其溶解温度（Tm）就
2、高。这样，人们通过控制溶解温度使富A=T区解链变性，而富GC区仍维持双链。 当利用单链核酸酶S，酶去除解开的单链部分，得到富GC区的DNA片段 。,二、鸟枪法(Shot gun) 又称霰弹法,用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上与一般基因大小相当的DNA片段（1000bp），然后，将这些片段混合物随机地重组入适当的载体，转化后在受体菌（如：E.Coli）中进行扩增，再用适当的筛选方法筛选出你所要的基因。,优点：操作简单，命中率较高。 缺点：盲目性大，阳性片段不一定正好是基因，样本多，可能会漏。,鸟枪法克隆目的基因的基本战略,1、随机酶切成基因相当大小的片段（约1000bp)；
3、 2、重组入适当载体（质粒）； 3、转化进宿主菌（E.coli)，扩增； 4、筛选出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。 鸟枪法适用于原核细菌 目的基因的克隆分离,三、基因文库法,cDNA文库（cDNA library) 则是将某生物特定的组织器官或发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的产物。,基因组文库(Genomic library)是将某一生物基因组DNA全部克隆后获得的重组子群体的总称。,基因文库(Gene library)是通过克隆的方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合
4、体。,构建基因文库的意义,1.通过基因文库的构建贮存和扩增特定生物基因组的全部或部分片段，保存物种遗传种质。 2.从基因文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因。 3.构建基因文库是研究基因本身的需要,如基因结构的分析、基因表达和调控的研究等。 基因组文库的类型: 质粒文库、噬菌体载体文库、粘粒文库、细菌人工染色体文库和酵母人工染色体文库。,几个物种基因组大小及基因数目,构建基因组文库应满足的条件,基因组文库的完备性：是从基因组文库中筛选出含有某一目的基因的重组克隆的概率。 基因组文库的大小: 1）基因组的大小； 2）克隆片断的长度； 3）从中分离特定基因的置信度。 N=1n(1一P)ln1-
5、L/G 式中P为期望概率，L为单个重组体的DNA片段的长度，G为基因组DNA的总长度。N是所需要的重组体数目,例如，某一哺乳动物基因组G=3x109bp，以17kb的随机片段克隆构建的文库中，使任一给定DNA序列达99的概率出现，则： Nln(1-0.99)ln1一(17x1033x109)=8.1x105 如果克隆片断长为20kb，则N=6.5X105 果蝇的基因组约1.5X108bp，以20kb克隆时，N=4X105,基因组文库的构建,(一）基因组DNA的分离制备 原核细胞的基因组包括其拟核的DNA和附加的遗传体系如质粒DNA，真核细胞的基因组包括其核基因组及细胞器如线粒体和叶绿体的DNA
6、。 质量必须满足：1. 结构具有相对完整性；2. 尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3. 保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及离子等。,（二）基因组DNA的片段化 1.限制性内切酶对DNA分子的酶解 两种方式：DNA完全酶解和DNA不完全酶解。,DNA完全酶解 人基因组DNA酶解琼脂糖凝胶 M：DNA分子marker；1：未酶解的人基因组DNA；2：Rsa I完全酶解后的DNA,M 1 2,DNA不完全酶解,人基因组DNA以Sau3A酶进行的不完全酶解 M：DNA分子marker；1：未酶解的基因组DNA；2-10：显示酶解的程度逐步提高,M 1 2 3 4 5
7、6 7 8 9 10,用DNA的随机片断克隆法来：机械剪切和部分酶切,1)随机片断的重叠性，能够沿某一克隆“步查”直至将整个染色体衔接起来（利用片段间重叠区的信息，可以将独立的重组子加以衔接，最后整个染色体的顺序连续出来：染色体步查 ）。,2)无须预知靶序列内部及其周围的限制酶切位点而仍能够分离DNA片段。,3)文库的规模减小。由于经过挑选而用于克隆的DNA片段大，形成一个哺乳动物基因组DNA文库所需的重组体数目显著减少。,DNA分子的物理剪切 运用识别4对碱基的限制性内切酶制备随机性DNA片断，具有了较高的随机性，但相对随机性更高的方式还是运用不依赖碱基序列的物理剪切方法。 DNA分子的物理
8、剪切可以采用DNA溶液的小孔喷射、超声波处理和高速搅拌等几种方式。,选择合适的构建基因组文库的载体： 1）要求有较大的克隆容量； 2）要求在置于宿主中扩增时有较高而均等的转化效率； 3）在重组子进行扩增时，扩增的机会相近； 4）可以较方便地进行文库的筛选。 基因组文库构建的常用载体：Lambda噬菌体载体、cosmid、BAC及YAC 。,（三）载体制备, 替换型载体进行基因文库的构建示意图,（四）重组连接 制备出的适当大小随机性基因组DNA与载体左臂右臂进行连接，实现左臂插入分子右臂的分子重组。构建文库时重组连接常采用相同粘性末端的连接，以替换型载体构建基因组文库多采用BamH I酶切末端与
9、插入外源DNA Sau3A I末端的互补连接。,（五）噬菌体离体包装：,宿主菌 蛋白,支架状 前头部,前头部,A蛋白结合在基因组 共聚体的cos位点,尾部,成熟噬菌体,头部,功能,噬菌体自组装及DNA包装过程,（六）重组噬菌体转染大肠杆菌,噬菌体包装物在宿主大肠杆菌菌苔上检验效价及形成噬菌斑,其他载体文库的构建 1.粘粒载体文库,2.酵母人工染色体文库 （yeast artificial chromosome,YAC）:,YAC含有酵母染色体自主复制序列、着丝点(centromere)、四膜虫的端粒（telesome以及酵母选择标记基因组成的能自我复制的克隆载体。并带有大肠杆菌质粒载体的复制元
10、件和选择标记。 酵母选择标记基因：色氨酸合成酶基因（TRP1），组氨酸合成酶基因（HIS4），尿嘧啶合成酶基因（URA3），赭石突变校正基因（SUP4）。 YAC 载体以环状的方式存在，可插入长度达100-2000kb的外源DNA。,与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌带有一个赭石突变 ade 2。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。 无义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变。其中密码子改变为UAG的无义突变又
11、叫琥珀突变，密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变。,细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，命名为pBACs，其装载量范围在50 - 300 kb之间。携带一个Cmr，严谨型复制子oriS, 解旋酶基因repE, 确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座parA, parB, parC及多克隆位点,重组分子导入受体细胞 以Lambda噬菌体载体和cosmid载体构建的重组分子在体外包装成噬菌体颗粒，通过感染细菌的方式将重组分子导入受体细胞。 以酵母人工染色体和细菌人工染色体载体构建
12、的重组分子采用电激转化法将重组分子导入受体细胞。,基因组文库的扩增筛选 1.文库的扩增 lambda载体的基因组文库是以噬菌斑的形式获得重组噬菌体的集合；cosmid载体的基因文库是存在于细菌中的大分子重组质粒，以独立的转化菌落形成集合； BAC文库也是以细菌菌落形式存在； YAC文库则以酵母菌形式出现。 噬菌体文库的扩增可以通过感染宿主，每一噬菌斑便是一个重组噬菌体扩增后的产物。用缓冲液将这些噬菌斑中的病毒洗脱下来，便获得了扩增后的文库。离心除出细菌碎片等杂质后，上清液加1-2滴氯仿，置于40C可以保存数年。 粘粒载体、BAC和YAC文库，则对转化的菌落单独编号、扩增和保存。,2.文库的筛选
13、,硝酸纤维素膜或尼龙膜,放射性标记探针进行文库杂交筛选,染色体步移(chromosome walking) 当基因的位置已知，但没有可用的探针，只知道同一染色体上的另外一个已经克隆的基因，就可以通过染色体步移方法克隆所需的基因。其基本原理是用探针筛选文库，得到阳性克隆后，将这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分(注意不能包含重复序列)作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分(即探针序列)是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛选文库。通过一系列的操作，得到的插
14、入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。,其基本策略是根据已知基因片段的末端序列合成探针，反复进行基因文库的筛选，知道满足需要为止。染色体步移是一项复杂、繁琐的技术，到目前为止，步移最大的距离时200-250kb。然而成功的报道很多，如人类的囊肿性纤维化疾病基因。,cDNA文库的优越性： 1 cDNA克隆以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒，例如流感病毒、脊髓灰质炎病毒和呼肠孤病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 2 cDNA基因文库的筛选比较简单易行。 3每一个cDNA克隆对应于一种mRNA序列，假阳性的概率就会比较低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的
15、阳性克隆将会含有目的基因的序列。 4cDNA克隆可用于在细菌中表达基因的产物。,cDNA文库的构建与筛选,cDNA文库的大小：,cDNA基因文库大小的估算公式 N=ln(l-P)/ln(l-f) N为cDNA基因文库必需的克隆的数目；P为文库中含目的基因cDNA片段的出现概率，一般情况下，期望值为99%；f是某种mRNA的丰度。,cDNA文库 用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后，建立的基因文库。简称c文库。,cDNA文库的构建： 1.cDNA文库构建的载体 cDNA是由mRNA反转录获得的互补DNA，分子大小通常分布在0.5kb10kb间。,2. cDNA的获得 a.分离mRNA 分离总体
16、RNA：利用guanidine thiocyanate（异硫氰酸胍） -mercaptoethanol（-巯基乙醇）使核糖体解体，而染色体不发生解体，再采用苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，获得RNA。 利用mRNA分子的3端都含有一段由20-250个多聚腺核苷酸组成的poly(A)尾巴将mRNA从细胞总RNA的混合物中分离出来。,GIT与巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库，因此为大多数人采用。与氯化铯方法比较，虽然纯度稍差一些，小分子RNA，如tRNA、snRNA不易去除，但产量高完整性好，盐易去除。,b. 对mRNA进行富集,已知要分离的目的基因mRNA的分子大小，通过凝胶电泳或蔗糖密度梯度离心，回收与目的基因mRNA分子大小相近的mRNA。 分离未知分子大小的目的基因cDNA,
