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1、实验一蛋白质含量测定 本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原 理和优缺点。 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前 常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret 法） 、Folin酚试剂 法（Lowry 法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法， 即考马斯亮蓝法（Bradford 法） 。其中 Bradford 法和 Lowry 法灵敏度最高，比紫外 吸收法灵敏 1020 倍，比 Biuret 法灵敏 100 倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较 准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质
2、。 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质， 因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法 都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的 灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的 时间。 考马斯亮蓝法（Bradford 法） ，由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化） ，氨又与硫酸作用，变成 硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被
3、中和 的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： CH2COOH |+ 3H2SO42CO2+ 3SO2+4H2O +NH3(1) NH2 2NH3+ H2SO4(NH4)2SO4(2) (NH4)2SO4+ 2NaOH 2H2O +Na2SO4+ 2NH3(3) 反应（1） 、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入 CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可 用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋 白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量
4、，即用样品中蛋白氮乘以 625 即 得。 五种蛋白质测定方法比较如下： 二、双缩脲法（Biuret 法）二、双缩脲法（Biuret 法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经 180左右加热，放出一个分子氨后 得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物，称为双缩脲反应。 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这 类化合物都有双缩脲反应。 方法灵敏度时间原理干扰物质说明 凯氏定氮法 (Kjedahl法 ) 灵敏度低， 适用于 0.2 1.0mg 氮， 误 差为 2 费 时 8-10 小时 将蛋白氮转化 为氨，用酸
5、吸 收后滴定 非 蛋 白 氮 （可用三氯 乙酸沉淀蛋 白 质 而 分 离） 用于标准蛋白 质含量的准确 测定；干扰少； 费时太长 双 缩 脲 法 （Biuret法） 灵 敏 度 低 120mg 中 速 2030 分钟 多肽键碱性 Cu2 紫 色 络合物 硫 酸 铵 ； Tris 缓 冲 液；某些氨 基酸 用 于 快 速 测 定，但不太灵 敏；不同蛋白 质显色相似 紫外吸收法较为灵敏 50100g 快速 5 10 分钟 蛋白质中的酪 氨酸和色氨酸 残 基 在 280nm 处的光吸收 各种嘌吟和 嘧啶； 各种核苷酸 用于层析 柱流出液的检 测；核酸的吸 收可以校正 Folin 酚 试剂法 （Low
6、ry 法） 灵敏度高 5g 慢速 40 60分 钟 双缩脲反 应；磷钼酸 磷钨酸试剂被 Tyr和Phe还原 硫酸铵； Tris 缓 冲 液； 甘氨酸； 各种硫醇 耗费时间长； 操作要严格计 时； 颜色深浅随不 同蛋白质变化 考马斯亮蓝 法 (Bradford 法) 灵敏度最高 15g 快速 5 15 分钟 考马斯亮蓝染 料与蛋白质结 合时，其max 由 465nm 变为 595nm 强碱性缓冲 液； TritonX- 100; SDS 最好的方法； 干扰物质少； 颜色稳定； 颜色深浅随不 同蛋白质变化 H2O O=CC=O HNNH R-CHCH-R O=CCuC=O HNNH R-CHCH-
7、R H2O 紫色络合物 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸 成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为 110mg 蛋白质。干扰这一测定的 物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质 少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确 的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1. 试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配 制成 10mg/ml 的标准蛋白溶液， 可用 BSA 浓度 1mg/ml 的 A280 为 0.66 来校正其
8、纯度。 如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度， 再根据其纯度， 称量配制成标准蛋白质溶液。 牛血清清蛋白用 H2O 或 0.9%NaCl 配制， 酪蛋白用 005N NaOH 配制。 （2）双缩脲试剂：称以 1.50 克硫酸铜（CuSO45H2O）和 6.0 克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O64H2O） ，用 500 毫升水溶解，在搅拌下加入 300 毫升 10% NaOH 溶液， 用水稀释到 1 升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中） 。此试剂可长期保存。 若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2. 器材： 可见光分光光度计、大试管 15 支、旋
9、涡混合器等。 （三）操作方法 1. 标准曲线的测定： 取12支试管分两组， 分别加入0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0 毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到 1 毫升，然后加入 4 毫升双缩脲试剂。充分摇 匀后，在室温（2025）下放置 30 分钟，于 540nm 处进行比色测定。用未加蛋白 质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横 座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取 23 个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白 质浓度。注意样品浓度不要超过 10mg/ml。 三、Folin酚试剂法（Lowry 法）三、Folin酚试剂
10、法（Lowry 法） （一）实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法， 由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购） ，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取 代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即 Folin酚 试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰 色的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。?Folin酚 试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰 色（钼兰和钨兰的混合物） 。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 Folin酚试剂法最早由 Lowry
11、确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物 化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多， 缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专 一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰 Lowry 反 应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘氨酸、 糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%） ，硫酸纳（1%） ，硝酸纳（1%） ， 三氯乙酸（0.5%） ，乙醇（5%） ，乙醚（5%） ，丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但 这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须
12、加浓碳酸钠氢氧化 钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠氢 氧化钠溶液的浓度 12 倍。 进行测定时，加 F olin酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性 pH 条件下 稳定，但上述还原反应只在 pH=10 的情况下发生，故当 Folin 一酚试剂加到碱性的 铜蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨酸试剂 被破坏之前，还 原反应即能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达 5g。通常测定范围是 20250g。 （二）试剂与器材 1.试剂 （1）试剂甲： 10 克 Na2CO3， 2 克 NaOH 和 0.25 克酒石酸钾
13、钠（KNaC4H4O6 4H2O） 。 溶解于500 毫升蒸馏水中。 0.5 克硫酸铜（CuSO45H2O）溶解于 100 毫升蒸馏水中，每次使用前，将 50 份 （A）与 1 份（B）混合，即为试剂甲。 （2）试剂乙： 在 2 升磨口回流瓶中，加入 100 克钨酸钠（Na2WO42H2O）,25 克钼酸钠 （Na2MoO42H2O）及 700 毫升蒸馏水，再加 50 毫升 85%磷酸，100 毫升浓盐酸，充 分混合，接上回流管，以小火回流 10 小时，回流结束时，加入 150 克 硫 酸 锂 （Li2SO4） ，50 毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾 15 分钟，以便驱除过量的 溴。冷却
14、后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤） 。稀释至 1 升， 过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准 NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后 适当稀释，约加水 1 倍，使最终的酸浓度为 1N 左右。 （3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或 球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为 250 g/ml 左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用 0.9 % NaCl 溶液。 2. 器材 （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）秒表 （4）试管 16 支 （三）操作方法 1. 标准曲线的测定：取 16 支大试管，1 支作空白，3 支留作未知样品，其 余试管分成两组，分别加入 0，0.
15、1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 毫升标准蛋白质溶 液（浓度为 250g/ml） 。用水补足到 1.0 毫升，然后每支试管加入 5 毫升试剂甲，在 旋涡混合器上迅速混合，于室温（2025）放置 10 分钟。再逐管加入 0.5 毫升试 剂乙（Folin酚试剂） ，同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度 减弱。然后在室温下放置 30 分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照， 于 700nm 处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座 标，绘制出标准曲线。 注意：因 Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制 时间，即第 1 支
16、试管加入 5 毫升试剂甲后，开始计时，1 分钟后，第 2 支试管加入 5 毫升试剂甲， 2 分钟后加第 3 支试管， 余此类推。 全部试管加完试剂甲后若已超过 10 分钟，则第 1 支试管可立即加入 0.5 毫升试剂乙，1 分钟后第 2 支试管加入 0.5 毫升 试剂乙，2 分钟后加第 3 支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置 30 分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先 画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升） ，并按由左至右，由上至下的 顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光 度值。 Folin酚试剂法实验表格： 管号12345678910 标准蛋白质00.10.20.40.60.81.0 （250g/ml） 未知蛋白质0.20.4 0.6 （约 250g/ml） 蒸馏水1.00.90.80.60.40.200.80.6 0.4 试剂甲5.05.05.05.05.05.05.05.05.0 5.0 试剂乙0.50.50.50.50.50
