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1、单克隆抗体制备技术,吕鹏辉,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术。 单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。,单克隆抗体制备流程,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,单克隆抗体制备技术含盖 抗原提纯与动物免疫技术 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 细胞融合技术及有限稀释法筛选法 细胞培养和保存技术 单克隆抗体的纯化技术,2020/9/20,北
2、京同生时代生物技术有限公司,细胞培养技术,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,细胞培养的基本概念传代 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。细胞培养：使用单个细胞悬液。组织培养：使用组织块（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,培养细胞的特性,培养细胞的生长方式 贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表
3、面。见于各种杂交瘤细胞. 半悬浮生长细胞 兼有悬浮和贴壁的生长状态。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,培养细胞生长的条件,1 细胞的生存环境 温度: 37 O2 CO2: 5% pH: 7.2-7.4 渗透压 无污染 无毒,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,CO2培养箱,使用时应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ，14 h)。 箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中
4、以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,压力蒸汽消毒器：湿热消毒 （120 ，0.5小时）。 用途广 电热干燥箱：干热消毒（180 ，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,滤 器,过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、 血清、酶液等均采用滤过法除菌,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,高速离心机 中速离心机,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,液氮罐 提桶,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,倒置显微镜,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,培养板
5、和培养皿等表面消毒,培养板 培养瓶,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,合成培养基 培养基是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、H-SFM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。 成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖
6、，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清。 对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚。 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程、
7、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,血清质量好坏是实验成败的关键。 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,培养基的配制,合成培养基 青、链霉素 1 加 10胎牛血清,2020/9/20,北京同生时代生物技术有
8、限公司,贴壁生长细胞传代方法,1 吸光培养瓶中的培养液 2 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 3 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 5 吸取1/41/3细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 7 将后者放入培养箱中培养。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,冻存和复苏,冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻
9、，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,细胞冻存方法,1预先配制冻存液： 含90%血清培养基 10% DMSO
10、 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml) 3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 4 年后，存活率可达80。DMSO液用培养液配好。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,细胞复苏方法,（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。 （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞 （5）继续培养，换液，以至形成单层。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,培养细胞活力测定,
11、细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。 测定的三种方法 1 细胞克隆形成率实验 2 台盼蓝法 3 四唑盐（MTT）比色法,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,台盼蓝法,活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力 。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,细胞计数,血细胞计数器：手工计数细胞 1.细胞计数板的准备：用70%的乙醇清洗计数板的表面，将盖玻片正确的放置于计数板上。 2.吹打EP管中的细胞悬液，吸取20ul的液体，在细胞计数板的边缘挤出细胞悬
12、液，利用毛细作用使之充满计数板和盖玻片之间的空隙。 3.选择一个10物镜进行计数。计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。 4.计算公式： 细胞悬液细胞数/ml=4个大格细胞总数/4 104 稀释倍数,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,注意事项,三要: 要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。 要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。 要定期进行再克隆。 三不要: 不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。 不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。 不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以
13、肿瘤生长形式连续传好几代。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,抗体制备技术,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,抗体的生产,获得稳定的杂交瘤细胞系后，即可根据需要大量生产单抗，以用于不同目的。1、单抗的大规模制备 目前大量制备单抗的方法主要有两大系统一是动物体内生产法，这是国内外实验室所广泛采用；一是体外培养法。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,动物体内生产法,最常用的方法，将杂交瘤细胞注射小鼠，待生成腹水抽取。 使用的动物首选BALB/c小鼠。本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗
14、体浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig），因此在很多情况下要提纯后才能使用，而且还有污染动物病毒的危险，故而最好用SPF级小鼠。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,操作方法： a.腹腔接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.2-0.5ml。b.7-10天后腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠5106/0.5ml。c.间隔5天后，每天观察小鼠健康及腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用19号针头采集腹水
15、，一般可连续采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水；d.将腹水离心（4000r/min 5分钟），除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-80冻存备用，或冻干保存。,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,体外培养生产单抗,要想在体外大量制备单抗，就必须进行杂交瘤细胞的大量（高密度）培养。单位体积内细胞数量越多，细胞存活时间越长，单抗的浓度就越高，产量就越大。 目前在杂交瘤细胞的大量培养中，主要有两种类型的培养系统。 一是悬浮培养系统，采用转瓶或发酵罐式的生物反应器，其中包括使用微载体； 二是细胞固定化培养系统，包括中空纤维细胞培养系统和微囊化细胞培养系统。
16、,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,抗体纯化,单抗纯化的方法有很多种，应根据具体单抗的特性和实验条件选择适宜的方法，常用的技术有DEAE离子交换层析柱、凝胶过滤法和亲和层析法等。 Protein G和Protein A亲和层析法 辛酸-硫酸铵沉淀法,2020/9/20,北京同生时代生物技术有限公司,亲和层析法 亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。 此法具有高效、快速、简便等优点。 琼脂糖凝胶Sepharose的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几
