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1、第十八章 基因诊断与基因治疗 (gene diagnosis and therapy),2,本章讨论二大方面内容,基因诊断 基因治疗,3,一. 基因诊断概念 ： 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否异常，从而对疾病作出诊断的方法。,第一节 基 因 诊 断,4,二. 基因诊断特点： 针对性强，特异性高 检测灵敏度和精确性高 实用性强，诊断范围广,5,三. 基因诊断常用技术方法,核酸分子杂交技术 聚合酶链反应（PCR）技术 生物芯片 基因测序,6,（一）核酸分子杂交技术 核酸分子杂交 是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下，与另一条互补的特异核酸链形成
2、稳定双链的过程。 主要依据： 碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交： A=T、 GC ; DNA与RNA杂交: A=U、 GC ; 变性： 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链,碱基互补,7,hybridization,DNA:DNA 5 A T G C C G A T 3 T A C G G C DNA:RNA 5 A T G C G T A 3 U A C G C A U RNA:RNA 5 A U G C U A C G 3 U A C G A U G C,8,利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单
3、链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。 核酸探针 是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。 探针标记物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类。,9,1.核酸分子杂交的分类 液相杂交： 待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应； 固相杂交： 待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。 常用固相杂交支持物： 硝酸纤维素膜、尼龙膜等,10,2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序,制备待测核酸样品,分离、变性、转移、固化DNA片段,
4、杂交,加入标记核酸探针,检测杂交信号,标记核酸探针,预杂交,制备核酸探针,漂洗去除未参与杂交的标记探针,11,3. 常用固相核酸杂交方法 Southern 印迹杂交法（Southern blotting ） Northern 印迹杂交法（Northern blotting ） 斑点杂交或狭缝杂交法 （Spot/ Slot blot hybridization） 菌落杂交（colony hybridization） 夹心杂交法（sanwich hybridization） 原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）,12,(1) Southern 印迹杂交法
5、 （Southern blotting ）,限制性内切酶酶切 检测杂交信号 提取DNA,Southern 法可用于检测特异的DNA序列片断、基因定位、分子量测定等。,13,（2）Northern 印迹杂交法 （Northern blotting ） （其基本过程类似于上述Southern法） 提取RNA样本RNA变性琼脂糖凝胶电泳分离转移至膜探针（标记DNA或RNA）与之杂交显影或显色检测信号。 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA,14,（3）斑点杂交或狭缝杂交法： 基本过程： 将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上用标记探针与之杂交自显影或显色反应检测杂交信号分析
6、结果。 优点： 简便、快速、灵敏、样本用量少； 缺点： 特异性不高，有一定比例的假阳性。,15,（4）菌落杂交（colony hybridization）,该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。,16,（5）夹心杂交法（sanwich hybridization）,片断A 检测探针 本法优点： 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。,17,（6）原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 DNA-DNA RNA-DNA 三
7、类杂交 RNA-RNA 该法优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。,有,18,（二）聚合酶链反应(PCR，polymerase chain reaction)技术,PCR是体外基因扩增技术。它利用体内DNA复制的原理和DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA的大量扩增。 1. PCR基本原理： PCR技术在模板、dNTP、Mg2+等条件下，用耐热的Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的循环过程（2530个循环），目的DNA可扩增100万倍以上。,19,（1）DNA模板
8、的变性 将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 ），并游离于反应体系中作为模板； （2）模板与引物的结合（退火或复性） 将体系温度降至合适温度（550C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3端）碱基序列互补结合。（由于加入的引物量远多于模板量，所以引物与模板的结合比例远大于模板自身的复性）；,20,（3）引物延伸 将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3端，使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。 以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸） （新合成的链可作为下一轮循环的模板） 按照上
9、述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。模板DNA 扩增倍数T=2n (n: 循环次数)。,21,PCR技术原理示意图,22,2. PCR各要素及其作用 （1） 模板 PCR模板可以是DNA或RNA。 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝； RNA作为模板时，需要： RNA cDNA PCR, 称此为RT-PCR. （2）耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在95稳定30分钟。从而保证PCR在94变性 55退火71延伸循环30次过程中不变性失活。 在PCR中，Taq DNA聚合酶应用最广泛。,逆转录,23,（3）引物 引物是根据已
10、知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为1530个碱基。 引物是保证PCR扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对PCR的成功至关重要。 引物设计原则如下：,24,引物设计应符合以下基本原则： 长度适宜，一般为1530个碱基； G+C含量，一般为4060； 4种碱基应随机性分布； 引物自身不应存在互补序列； 两个引物之间不应有多于4个碱基的互补； 引物3端不应有任何修饰； 引物5可以修饰。,25,（4）缓冲溶液与Mg2+ PCR技术常用1050mmol/L Tris-HCl、Ph8.38.88、偏碱缓冲液；并含有一定量的Mg2+浓度； （5）dNTP浓度 P
11、CR一般用50200mol/L的dNTP；并且4种dNTP浓度应相等；,26,（6）参数 变性温度与时间 一般选择： 940C， 30秒 退火温度与时间 取决于引物长度、浓度 和G+C含量， 一般选择： Tm - 5 延伸温度与时间 一般选择： 70 75 循环次数 取决于模板浓度， 一般循环：30次,27,PCR操作 各种PCR反应的操作基本相同，只是根据 引物与靶序列不同，选择不同的反应体系和循环参数。 将PCR反应管置于DNA自动化热循环仪上，输入各种循环参数，使DNA扩增在热循环仪上很方便地完成。 PCR技术优点 特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快速、特异地扩
12、增任何DNA片断。 PCR缺点 由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。,28,3. PCR产物分析 （1）凝胶电泳分析法 可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。 同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。 （在待检靶序列拷贝数多、且仅扩增出一条带时，用此法即可满足检测要求。）,29,（2）点杂交分析法 该法有2种： 将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备一张膜，然后用不同的特异探针进行杂交； 将不同的探针固定在膜上，再用有标记的PCR产物 与之杂交。 本法有助于检测突变DNA类型，用于人类遗传
13、病诊断合某些基因的分析。 (当扩增产物时多条带时，用此法更合适。),30,(三)生物芯片 DNA芯片或基因芯片属于生物芯片的一类。,31,(四) 基因测序 即，DNA碱基序列分析，这是最确切、最直接的基因诊断方法。 目前常用的方法为Maxam-Gilbert建立的化学裂解法和Sanger建立的双脱氧末端终止法。,32,四. 基因诊断的临床应用,(一) 遗传病的基因诊断 (二) 肿瘤的基因诊断 (三) 感染性疾病的基因诊断,33,举例： 镰刀状红细胞贫血 珠蛋白基因的第六个密码子AT 表达产物：谷氨酸缬氨酸 一个碱基突变缺失1个Mst内切酶位点 正常人： 1.1kb 患者： 1.3kb,34,5
14、,3,5,3,1.1 kb,1.3kb,Mst II酶切位点（CCTNATG）,正常基因,突变基因,1.3kb,1.1kb,0.2kb,1,2,3,1、正常人 2、突变携带者 3、患者,35,第二节 基因治疗 基因治疗的概念 基因治疗的总体策略 基因治疗的基本程序 基因治疗的现状与展望,36,一、基因治疗概念 狭义概念 将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。 广义概念 将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。,37,二、基因治疗的总体策略 基因矫正 基因置换 基因增补 基因失活 “自杀基因”的应用 免疫基因治疗 耐药基因
15、治疗,38,（一）基因矫正（gene correction） 对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能； （二）基因置换（gene replacement） 用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态；,39,（三）基因增补（gene augmentation） 将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能 ，但致病基因未去除。 （四）基因失活（gene inactivation）： 指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互补作用与mRNA结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常表达，以抗肿瘤、抗病毒。 反义RNA: 干扰mRNA的互补RNA; 反义DNA: 干扰DNA的互补DNA.,40,（五）“自杀基因”的应用 自杀基因 这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将 原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将 细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因”。 自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。 但对正常细胞则无伤害作用。,41,（六）免疫基因治疗 将某些细胞因子（IL-2、GM
