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1、第二节基因工程的基本操作步骤,基因工程的核心： 让目的基因在宿主细胞中稳定存在和高效的表达,看视频总结基因工程需要哪些步骤？,获得目的基因,形成重组DNA分子,将重组DNA分子导入受体细胞,筛选含有目的基因的受体细胞,目的基因的表达,基因工程基本操作步骤,一、获得目的基因,1、目的基因较小且序列已知用化学方法直接人工合成。,2、目的基因的全部或部分序列已知用聚合酶链式反应（简称PCR）技术扩增,3、目的基因的序列是未知的从基因文库中获取目的基因,用某种限制酶切成多个片段,提取某种生物的DNA,第一步：建立基因文库（一般已做好）,将片段与载体连接起来,导入受体菌（常用大肠杆菌）群体中,第二步：从
2、基因文库中获取目的基因,根据目的基因的产物等特性，用原限制酶将目的基因切下。,用与切下目的基因的同种限制酶切开载体DNA,二、形成重组DNA分子,用DNA连接酶连接目的基因和载体DNA，形成重组DNA分子。（重组质粒或重组病毒）,三、将重组DNA分子导入受体细胞,构建重组质粒,四、筛选含有目的基因的受体细胞,导入,只有含重组DNA分子的细胞能生长,含四环素的培养基,含氨苄青霉素的培养基,含目的基因,五、目的基因的表达,受体细胞是原核细胞时，目的基因可留在质粒上； 受体细胞是真核细胞时，目的基因必须插入染色体DNA。,检测目的基因是否插入了受体细胞染色体DNA中DNA分子杂交技术,将DNA固定在
3、膜上，加热解旋,将带有放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段（探针，一般为单链）加到膜上,提取受体细胞基因组DNA,一段时间后冲洗,检测膜上是否有杂交带（放射性）,检测目的基因是否转录分子杂交技术,固定在膜上的变成mRNA，探针与相同,检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交,检测生物个体是否出现相应性状,活动：完成“基因工程操作程序的模拟操作”,思考： 基因工程的理论基础是什么？,原核生物界,原生生物界,植物界,动物界,真菌界,DNA的结构和功能,转录,翻译,遗传信息的表达机制相同,整个生物界共用一套密码子,二、基因工程的理论基础,DNA的结构相同（双螺旋结构） DNA功能相同（即复制方
4、式和表达机制相同） 整个生物界共用一套密码子,哪些技术能保证基因工程能够实施？,获得目的基因,形成重组DNA分子,将重组DNA分子导入受体细胞,筛选含有目的基因的受体细胞,目的基因的表达,工具?,限制酶 DNA连接酶 载体:质粒、病毒,（3）蛋白组分析 蛋白质合成后，还要进行磷酸化、糖基化、除去末端氨基酸、蛋白质剪切等翻译后修饰，仅从核酸的序列并不能完全描述一个蛋白质。尽管分析不同细胞类型中表达的蛋白已近20年，直到2019年才由Wilkins和Williams提出一个与基因组相对应的名词蛋白组分析的核心技术是蛋白质双向电泳。,技术上三大发明： （1）基因转移载体的发现1967，T.F.Rot
5、h&D.R.Helinski，发现质粒的自我复制能力，并能够在细菌之间转移。基因是可以转移的。 （2）工具酶的发明1972 H.C. Smith 、W.Arber & D.Nathans从流感嗜血杆菌中分离得到限制性内切酶；1970年， 逆转录酶的发现使真核细胞的 基因制备成为可能；此后，多种限制酶和连接酶发现。基因是可切割的。 （3）DNA体外重组的实现1972年， 美 Berg 第一次构建出了体外重组DNA分子。 重组DNA表达实验的成功1973，H.Boyer & S.Cohen选用仅含单一EcoRI酶切位点的载体质粒pSC101，使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段重组。重组的DN
6、A转入大肠杆菌DNA中，转录出相应的mRNA。基因工程诞生元年,技术进一步推动基因工程的发展： （1）第一例转基因动物和转基因植物问世1980 科学家通过显微注射培育出世界第一个转基因小鼠。1983，科学家采用农杆菌转化法，培育出世界上第一例转基因烟草。 （2）PCR技术的发明1988年， 美 K.Mullis发明PCR技术，使基因工程进一步发展。,The Nobel Prize in Chemistry 1993,for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method,Kary B. Mullis La Jolla, CA, USA,为了将上图的目的基因与左图的质粒结合，应该用_限制酶切开质粒，这是为了保证目的基因两端与质粒露出的_能够碱基互补配对，之后在_ _作用下才能够牢固结合，形成一个_。将重组质粒导入受体细胞后，受体细胞将获得_能力。,EcoR.1切点,Hand.3切点,Taq.1切点,抗四环素基因,EcoR.1,重组质粒,用EcoR.1切割下来的目的基因,思考题,黏性末端,DNA连接,酶,抗四环素,
