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1、食品中大肠菌群的检验,1. 食品微生物检验的意义,有害微生物对人类和生产的影响： 引起食品变质 引起食物中毒 导致人体患病,1. 食品微生物检验的意义,是衡量食品卫生质量的重要指标,也是判定被检食品能否食用的科学依据 可以判断食品加工环境及食品卫生的情况,为卫生管理工作提供科学依据 可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生 保证产品的质量,避免不 必要的损失,生产环境的检验,原辅料的检验,食品加工、储藏、销售 储环节的检验,食品的检验,2. 食品微生物检验的范围,3. 食品卫生标准中的微生物指标,指示菌 概念:在常规安全卫生监测中，用以指示检样卫生状况及安全性的指示性微生物 类型：一般性
2、、特定性（如粪便污染）、其他 项目：菌落总数 、大肠菌群、耐热大肠菌群、总大肠菌群 食源性致病菌及其毒素 沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌及其肠毒素、溶血性链球菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲菌、致病性大肠埃希氏菌等 霉菌酵母菌及其毒素 黄曲霉毒素B1 、B2等 其他项目 抗生素残留、beta-内酰胺酶、 商业无菌等,商业无菌,概念：罐头食品经过适度的杀菌后，不含有致病性微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物。这种状态叫做商业无菌。 保温： 低酸性罐头食品36 ，10天 酸性罐头食品30 1 ，10天 预定输往热带地区的低酸性食品55 1
3、，57天 每日检查 是否胖听、泄露开罐留样pH测定感官检查涂片染色接种,4. 常用仪器设备,4.0 光学显微镜 4.1 培养箱 4.2 水浴箱,4. 常用仪器设备,4.3 超净工作台：侧流式、直流式和外流式 4.4 干燥箱 4.5 高压蒸汽灭菌器,4. 常用仪器设备,4.6 离心机 4.7 滤菌器 4.8 均质器（匀浆器） 4.9 冰箱,4. 常用仪器设备,玻璃器材及其他 试管 三角烧瓶 烧杯 玻璃棒 培养皿 接种环 涂布棒 酒精灯 移液管 移液器 剪刀、镊子 试管架,一、实验目的,1. 了解大肠菌群在食品检验中的意义。 2. 掌握检验的程序和步骤。 3. 通过MPN检索表的检索得出实验结果。
4、,二、基本原理,大肠菌群系指一群在3237下24h内，能发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。具有广泛的卫生学意义。,大肠菌群的食品卫生学意义,作为粪便污染食品的指标菌，MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低 作为肠道致病菌污染食品的指针，大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系 要求食品中大肠菌群完全不存 在是不可能的，重要的是其污染 程度即菌量,产气克雷白氏菌,大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪
5、便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染 。,大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。,总大肠菌群系指一群在37培养24小时能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。,耐热大肠菌群即粪大肠菌群，作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表
6、对人有什么直接的危害。,致病性大肠杆菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞，具有痢疾杆菌样致病力。肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠毒素性大肠杆菌（ETEC）和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）等。,O157:H7（EHEC) 肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。,大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系,GB 4789.3-2010 大肠菌群计数 第一法：大肠菌群MPN计数法 第二法：大肠菌群平板计数法,三、检测方法,第一法：大肠菌群MPN计数法,大肠菌群计数检验流程,0,将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤,LST不
7、产气（-） 小导管里无气泡,LST产气（+）,需要用到的培养基,（1）LST肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨 成分：胰蛋白胨或胰酪胨（Tryticase）20g，NaCL 5.0g，乳糖5.0g，K2HPO4 2.75g，KH2PO4 2.75g，月桂基硫酸钠0.1g，蒸馏水1000mL。 制法：将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm150mm试管中，每管10mL。121高压灭菌15min。最终pH6.80.2。,（2）BGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤 成分：蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，牛胆粉溶液200mL，0.1%煌绿水溶液13.3mL，蒸馏水800mL，pH7.20.1。 制
8、法：略,抑菌剂的选择,大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。 抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。 抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。,实验步骤及操作要点：,1）无菌取样并制作梯度稀释液； 2）样品匀液的pH 值应在6.57.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。 3）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 mi
9、n。,4）初发酵试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），361 培养24 h2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。,LST结果判断,大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。,5）复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物
10、1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 1培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。,6）大肠菌群最可能数（MPN）的报告 按5）确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。,表B.1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表,第二法：大肠菌群平板计数法,需要用到的培养基,（1）VRBA：结晶紫中性红胆盐琼脂 成分：蛋白胨7.0g，酵母膏3.0g，乳糖10.0g，氯化钠5.0g，胆盐或3号胆盐1.5g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g18g，蒸馏水1000mL，pH7.40.1,1）样品的稀释：如第一
11、法 2） 平板计数 选取2个3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。 3）及时将15 mL20 mL冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 1 培养18 h24 h。,实验步骤及操作要点：,4）平板菌落数的选择 选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。,典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。,
12、5）证实试验 从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 1 培养24 h48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。,6）大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以4）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。 例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。,三 大肠菌群PetrifilmTM测试纸片法,四、美国FDA标准方法,行业标准采用两步法：,用于对出口食品中大肠菌群进行检验,思考题,1大肠菌群的检验分哪几个步骤？各有何作用？ 2在糖发酵试验中，若发现发酵倒管内存在极微小的气泡，这种情况可否算作产气阳性？ 3造成本实验误差的主要原因有哪些？,
