分离科学---第八章 高效毛细管电泳课件

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1、,高效毛细管电泳 (High performance capillary electrophoresis, HPCE) 高效毛细管电泳是离子或者荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按照其淌度和/或分配系数不同，实现高效、快速分离分析的一种电泳新技术。,电泳技术发展历程： 1937年瑞典科学家Tiselius首次采用电泳技术，分离人血清中5种蛋白。 1981年Jorgenson用75m内径毛细管，利用区带电泳实现了正负离子的分离分析，成为毛细管电泳技术的里程碑。 1983年，Hjerten发展了毛细管凝胶电泳。 1984年，Terabe等发展了胶束电动色谱，使中性化合物的CE分离成为可能。 198

2、7年，Hjerten提出了毛细管等电聚焦电泳。 1989年出现商品CE仪器，为推广应用起到了促进作用。,人类基因组研究计划中发挥了巨大的作用,毛细管电泳特点 分离模式多，转换容易，适用范围广。 分离效率高。理论塔板数40万块/m。 速度快。多数30min，最快几秒钟。 试剂和样品消耗少。分离溶剂仅为几l，进样量nL（10-9L）级。 成本低，操作简便，环境污染小。 应用领域十分广泛。在生命科学、药学、医学、中药分析、食品化学、环境化学和法医学等领域都得到广泛的应用。,毛细管电泳基本原理 预备知识：双电层和Zeta电势 双电层 由界面化学可知，固体与液体接触时，固体表面分子离解或者（和）表面吸附

3、溶液中的离子，在表面形成双电层。,吸附层 （紧密层）,双电层模型和相应的电势分布,扩散层,0为表面电势，紧密层中电势线性下降至d。剪切面上的电位称为Zeta电势（），略低于d，一般认为与d相等。 表面吸附了非离子表面活性剂或大分子后，剪切面外移，与d差别变大，甚至会改变符号。,当d衰减到原来的1/e时，离紧密层的距离定义为扩散层的厚度（）。 Zeta电势正比于扩散层厚度 。毛细管壁上的Zeta电势为：,e为溶液中每单位面积总的过剩电荷，为介质的介电常数。,带电粒子在其有效半径所组成的面存在Zeta电势：,扩散层的厚度与电解质的浓度有关，确切地说与离子强度有关。对于二元电解质，近似有：,电泳（E

4、lectrophoresis） 在半导电流体中，带电粒子在外加电场作用下的泳动现象叫电泳。带电粒子的移动速度可以表示为：,球形粒子：,棒状粒子：,影响电泳速度的因素： 电场强度E 介质特性（介电常数和粘度） 粒子的有效电荷 粒子大小和形状 因此，荷质比差异是电泳分离的基础。,淌度（Mobility, ） 因为电泳速度与外加电场强度有关，所以，在电泳中常用淌度而不用速度来表示带电粒子的电泳行为和特性。,绝对淌度（absolute mobility,mab） 无限稀释条件下单位电场强度下离子的平均迁移速度。它是该离子在一定溶液中的一个特征物理常数。在手册中可以查到一些离子的绝对淌度。,有效淌度（e

5、ffective mobility,ef） 有效淌度是实验测出的离子淌度，它是所有产物的离解度（i）和分子的第i离子形式的绝对淌度乘积之总和：,ef取决于许多因素，包括离子半径，溶剂化作用，介电常数，溶剂粘度，离子形状、电荷、pH、离解度和温度等。,电渗流（Electroosmotic flow, EOF） 在毛细管中，电渗流指的是体相溶液在外加电场下整体朝一个方向运动的现象。,（A）EOF不存在流速场，无展宽；（B）HPLC存在流速场，展宽大。,电渗流在CE中的意义 将正、负离子和中性分子一起朝一个方向产生差速迁移 通过EOF的大小和方向的控制，还可以影响CE 的分离效率，选择性和分离度 E

6、OF的细微变化会影响CE分离的重现性（迁移时间和峰面积）。,EOF速度的大小与毛细管管壁的Zeta电势有关：,式中为0真空介电常数。 类似于电泳，常用电渗流系数或电渗淌度来表示EOF大小：,影响电渗流的因素主要有： 电场强度E 毛细管材料 溶液的pH 电解质溶液的成分和浓度 添加剂 温度,eo E关系曲线,电场的影响,EOF和pH的关系曲线,毛细管材料以及pH的影响,电解质溶液的成分和浓度,相同浓度的不同的电解质，溶液的介电常数、离子强度以及粘度不同； 同一缓冲液，浓度增大、离子强度增加，双电层变薄，Zeta电势下降，因此EOF变小。,50mmol/L钠盐缓冲液中测得的电流和电渗淌度（pH8.

7、0）,添加剂对EOF的影响 中性盐（K2SO4），双电层变薄，EOF降低； 两性离子（四甲基氯化铵）增加溶液粘度，降低pH，EOF降低； 有机溶剂甲醇、乙腈等降低离子强度（有利于提高Zeta电势）、粘度。但通过氢键或偶极作用于管壁，改变表面电荷，这些共同作用的结果一般使EOF变小。 表面活性剂，显著改变毛细管内壁的电荷特性。当表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度以后，将形成胶束，这个时候CE的分离机理会发生变化。,阳离子表面活性剂浓度对eo的影响（pH9.1）,温度对EOF的影响 温度对EOF的影响是线性的。EOF随温度的变化主要是温度影响粘度变化的结果。温度升高时，溶液粘度下降，因此EOF变大。

8、 由于焦耳热的存在，毛细管内溶液的温度会发生变化引起柱效下降，以及分离时间重现性较差，因此，良好的散热是非常必要的。一般有空气冷却和液体冷却两种方式。,调控EOF的方法： 改变缓冲液成分和浓度 改变pH 加入添加剂 毛细管内壁改性（物理或化学方法涂层及动态去活） 改变温度 外加径向电场（改变管壁的Zeta电势）,溶质有效迁移速度和表观淌度 在CE中由实验决定的实际的离子迁移速度，称为有效迁移速度（vef）：,ap称为表观淌度（apparent mobility），或者净淌度（net mobility）。,分离效率和分离度 理论塔板数 Giddings方程定义为：,纵向扩散是区带展宽的最主要因素

9、,使用高电场 EOF速度快 扩散系数小的溶质,分离度,外加电压（V）； 有效长度和总长度之比（l/L）； 电泳有效淌度差（ef）； EOF淌度（eo）。,区带增宽的因素 （1）扩散 径向扩散影响小，纵向扩散影响大 （2）进样,（3）温度效应 焦耳热散时形成径向温度梯度,为当量电导,由焦耳热引起的分散系数可表示为：,一般情况下，如果满足下述方程，那么焦耳热热就不会引起太严重的谱带展宽 Ed(c)1/31500 E为电场强度，单位KV/m，c是介质浓度，单位mol/L，d为管径，单位m。,kb背景电解质的热导率，d/dT为溶质淌度的温度系数。,控制焦耳热和温度梯度的方法： 降低电场强度 减小毛细管

10、内径 降低缓冲液的离子强度或浓度 用物理方法控温,（4）溶质与管壁的相互作用-吸附效应 静电引力 疏水相互作用 极端pH，即pH23或pH 9但是极端pH下蛋白质结构会变化甚至水解。 加入中性盐，抑制静电吸附作用，但焦耳热大 加入两性离子化合物如(CH3)3N+CH2CH2CH2SO3-抑制蛋白质吸附 毛细管内壁涂层 动态或者静态地对毛细管内壁进行涂层处理 抑制吸附的方法在一定程度上会影响EOF，实际样品分析中，应该根据具体情况综合考虑。,（5）电分散 电分散来源于样品塞与缓冲溶液之间电场强度的差异。,s样品 b背景电解质,样品和背景电解质的ef相近电分散小，峰对称。 ef比背景电解质小很多的

11、溶质峰拖尾，ef比背景电解质大很多的溶质峰向前倾斜。,（6）检测器 峰的宽度或区带宽度为时间宽度（Wt），实际长度相等的区带产生时间宽度不等的峰，需校正，否则会给计算柱效和定量分析带来误差。,检测器的空间宽度（Wd）不同，紫外检测器几百微米，电导检测器小于50微米，需校正,（7）其它增宽因素层流 两端缓冲溶液不在一个水平面上，高度差诱导产生层流。对于扩散系数小的溶质，以及内径大的毛细管，这种层流的影响非常显著。 场放大CE中的层流效应。在场放大CE中，由于电场强度（由缓冲溶液浓度不同引起）的非均匀分布，导致局部EOF速度差异，在浓度界面两侧产生电渗压，此压力差使得在高、低浓度区域产生层流。,影

12、响CE分析因素 电泳： pH，缓冲液种类和离子强度，电场强度，温度，添加剂，有机溶剂等。 电渗流： pH，缓冲液种类和离子强度，电场强度，温度，添加剂，有机溶剂和毛细管壁的改性等。,毛细管区带电泳（CZE） （capillary zone electrophoresis） 原理： 在充满电解质溶液的毛细管中，荷质比大小不同的组分在电场的作用下，按照迁移速度的不同而进行分离的。 毛细管电泳中使用最为广泛的一种技术。,以球形粒子为例,荷质比不同是CZE分离的基础。 样品分子本身荷质比不同（pH调控） 与其他试剂作用后产生荷质比差异（配位、形成主客体化合物等）,硼酸根-糖；磺化环糊精-样品,CZE分

13、离的调控因素 （1）操作电压,欧姆定律曲线（最佳电压的选择）,恒压-最常用，tm与电压的倒数成正比。如果考虑到焦耳热效应，这种函数关系不成立。 恒电流-理论证明，tm与电流I成正比，在缓冲溶液浓度较大或者散热差的情况下，使用恒电流操作会得到较好的结果。 恒功率-严格地讲，毛细管内焦耳热的多少与毛细管内产生的功率成正比，恒功率模式操作可获得好的重现性。 程序改变电压、电流或功率，从而提高分离度，改善峰形，优化分析时间。,（2）缓 冲 液 缓冲溶液类型-影响溶质的流体力学半径 浓度-离子强度不同，粘度不同 pH-离解程度不同，电荷不同,pH7.0条件下分离丹酰化氨基酸时，相同浓度的NaH2PO4比

14、KH2PO4的分离度高，分析时间短。,分离glycoforms A：乙酸盐0.1mmol/L，Ph4.0； B：乙酸盐-磷酸盐，0.1mmol/L，Ph4.0；,缓冲液选择方法： 有好的缓冲容量 尽可能选择浓度大而产生电流小缓冲溶液，即分子大而荷电小的缓冲介质 表观淌度接近样品的表观淌度 不影响检测 常用的缓冲溶液有磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷（Tris）以及一些两性有机离子化合物如2-N-环己基乙磺酸等。,（3）添加剂 控制EOF大小和方向 抑制吸附 稳定溶质的结构如蛋白质的三级结构 增加疏水溶质的溶解度 扩大分离对象，如添加手性物质进行手性分离，添加络和剂分离中性分子等。,表

15、面活性剂-浓度低于其临界胶束浓度，用作助溶剂和离子对试剂，或壁表面改性剂 中性盐-减弱静电作用，抑制管壁对生物大分子的吸附作用，某些盐如LiCl可稳定蛋白质的三级结构的作用 两性离子添加剂-抑制管壁对生物大分子的吸附作用 有机溶剂-EOF降低、粘度降低、离子强度降低，电导率降低、脂溶性样品溶解度增加。例如在30%有机溶剂存在下，SO42-/NO3-的迁移顺序会发生反转。 手性添加剂-环糊精衍生物、冠醚衍生物进行手性物质分离 尿素等起到助溶和改变分离选择性的作用。,（4）温度 温度增加，粘度减小，淌度增加，分析速度加快，但扩散增加 温度高时进样体积大。压力进样，溶液粘度小了，因此进样体积大。电迁

16、移进样，离子淌度大了，毛细管电流大，进样体积同样增大 引起生物大分子结构和生物特性发生变化 影响溶质化学平衡,温度对肌红蛋白分离的影响,原因是血红素中的Fe由Fe（III）还原成Fe（II），温度升高加速还原的发生和进行（氨基酸残基作为还原剂）。,50mmol/LNa2B4O7（pH9.3） 1、甘露糖；2、半乳糖；3、葡萄糖；4、木糖 20C时，峰显著宽而且葡萄糖与木糖分不开。温度升高，分离效率明显增大。原因是络和反应平衡速度加快，产生更加窄的峰。,温度对单糖CZE分离的影响,CZE动态分离 前面讲的CZE，是样品在均匀电场下进行分离的。类似于液相色谱中的梯度淋洗，动态调节背景电解质的组成（浓度、pH），可以在CE分离中形成梯度变化，或者局部基质动态变化，即在非稳态介质中和非均匀电场下进行CZE分离。,非均匀电场下的CZE分离： 外加电压前，毛细管充满电解质1，称为初始电解质。其电阻率为r1，R=Lr1为毛细管内电阻。因为填充的是均匀电解质，因此纵向的电场是