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1、1,第五章 DNA分子基本操作技术,2,3,2013年诺贝尔生理学或医学奖,北京时间10月7日下午5点30分，美国、德国三位科学家詹姆斯-E.罗斯曼、兰迪-W.谢克曼及托马斯-C.苏德霍夫因在细胞内运输系统领域的新发现而获得今年诺贝尔生理学或医学奖。诺奖委员会说，三人发现了细胞囊泡交通的运行与调节机制。,4,膜融合的发现表明蛋白质和其他物质可以在细胞内和细胞间进行传递，细胞可以用这一过程来阻止它们的活动并且避免混乱。这一突破性发现解释了为什么胰岛素释入血液时会有变化、神经细胞之间的信息传达，以及病毒感染细胞的方式。,5,生物体内细胞的正常运转有赖于让合适的分子在合适的时间抵达合适的位置。一部分
2、分子，如胰岛素，需要被转运出细胞之外，而其他分子则需要被在细胞内部进行运输。细胞内部产生的分子被包裹于囊泡之中（图中蓝色表示），但是这些囊泡具体是如何达成这种精准的运输的？这一点一直没有被理解。,6,Randy W. Schekman发现基因控制下的蛋白质在这种囊泡运输机制中起到重要作用。正如这里的图上所展示的那样，通过对比正常酵母菌细胞（左）和转运机制缺陷的细胞（右），他成功识别出操控这一转运过程的基因。,7,James E. Rothman发现一种蛋白质化合物（图中橘色表示）可以让囊泡实现与目标细胞膜的融合。囊泡上的蛋白质物质会与目标细胞膜上的特定蛋白质之间发生结合，从而让囊泡可以在正确的
3、位置上释放其所运载的特殊“分子货物”。,8,Thomas C. Sdhof研究了大脑中神经细胞之间是如何互相传递信号的，以及钙离子在这一过程中所起的作用。他识别出一种分子机制（图中用紫色表示），其可以对进入的钙离子发生反应并触发囊泡融合，从而解释了囊泡输运机制中时间的精确性是如何达成的，以及其所携带的信号分子物质是如何能做到受控释放。,9,约翰.戈登 山中伸弥 获奖理由：发现成熟细胞可被重编程变为多能性,2012年诺贝尔生理学或医学奖,第五章 DNA分子基本操作技术,10,11,从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操
4、作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。,12,本章内容,第一节 核酸凝胶电泳技术 第二节 核酸分子杂交 第三节 PCR 第四节 转化 第五节 基因组文库构建 第六节 RNA操作技术 第七节 基因克隆,13,一、常规电泳 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 二、脉冲凝胶电泳,第一节 核酸凝胶电泳技术,14,一、常规电泳,自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在
5、通用的许多分子生物学研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。 基本原理：生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。,15,在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚
6、阴离子（polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。,大分子量的DNA 移动的慢,小分子量的DNA 移动的快,电泳缓冲液,阳极,阴极,DNA加样孔,16,17,18,1、琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解
7、温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等,19,1）凝胶浓度选择,琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围,凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。,20,2）电泳缓冲液,常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使
8、DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解,21,10TBE缓冲液的配制,配方 Tris 108克 EDTA 9.3克 硼酸 55克 H2O至 1000ml pH应为8.08.2 临用时用水稀至0.5TBE（20倍稀释）,22,3）核酸电泳的指示剂,指示剂： 溴酚兰 二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色,23,核酸电泳的指示剂,二甲苯青：水溶液呈兰色 电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当,24,4）载样缓冲液,指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液 作用： 增加样品密度，使其比重增加，
9、以确保DNA均匀沉入加样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色，使加样操作更方便,25,溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。,5）核酸电泳的染色剂,26,在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭（ethidium bromide，简称EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。,在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DN
10、A分子发出荧光,27,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间,28,称样,溶解,加热,制板,倒胶,6）核酸电泳操作基本程序,29,取样,点样,电泳,检测,核酸电泳操作基本程序,30,结果,31,根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小,32,Agarose gel electrophoresis,33,2、聚丙烯酰胺凝胶电泳,适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析 其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分离,34,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱
11、基对到1000个碱基对之间,35,聚丙烯酰胺凝胶,由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED（N，N，N，N一四甲基乙二胺）和过硫酸铵（AP）的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的,36,1）不同浓度丙烯酰胺和DNA有效分离范围,37,2）材料,电泳仪器： 电泳仪 垂直电泳槽及其附件. 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺，29克 N，N一亚甲基双丙烯酰胺，1克 H2O，加至100ml装于棕色瓶内，4可保存二个月,38,2）材料,10%过硫酸铵 过硫酰铵，1克，加水至 10 ml4可
12、保存一周，-20可保存一个月 1TBE电泳缓冲液 TEMED（四甲基乙烯基二胺）,39,3）聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳,配胶：根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶 按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出 将装好的玻璃电泳板倾斜成4560角 按表配制所需%浓度凝胶的毫升数 加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止,40,立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10角，可减少液体泄漏的机会 室温聚合一小时
13、后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1TBE缓冲液,41,小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则 将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡,42,接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳 电泳毕，切断电源，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上，浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，1530min后取出水洗，紫外仪下观察结果 聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng以上量的DNA条带（要求更高的灵敏度，可用银染）,43,44
14、,电泳结果分析,DNA Marker DNA 人工片段 100 bp ladder,45,酶切分析,根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶进行酶切 酶切产物电泳分离后，获得符合理论的片段 此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究,46,PCR-RFLP,46,47,二、脉冲凝胶电泳(PFGE),普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于50kb的DNA分子，而要进行超大分子研究，要用到脉冲电场凝胶电泳。 超过一定大小的线状DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（50Kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，在常规电泳凝胶中彼此挤压，形成单一DNA迁移带。1
15、984年Schwartz和Cantor首次利用脉冲凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis, PEGE ）解决了这一问题。,48,PFGE 工作的基本原理,49,PFGE 工作的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小，小分子DNA比大分子DNA更容易在凝胶中重新定位，因而迁移速度更快。该法可分离长至10Mb的DNA分子。,50,正交交变电泳凝胶电泳(OFAGE),电场逆转凝胶电泳(FIGE),夹角等值均一电场(CHEF),旋转胶系统,PEGE类型,51,影响PFGE分辨率的因素
16、,1、脉冲时间（0.1s-1000s）：增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。 2、电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。 3、电场夹角：电场方向的夹角常为110O - 120O，研究证实90O夹角也非常有效。 4、温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在4进行。较高的温度DNA泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。,52,第二节 核酸分子杂交 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。,53,核酸的分子杂交,将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。,54,不同温度
