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1、分子标记技术,-RAPD-PCR、ISSR-PCR,王春玲,指导老师：王慧中 应奇才,分子标记概述,分子标记是遗传标记中非常重要的一种，它是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。 优点：它直接以DNA形式出现，不受限制，不存在表达与否的问题；数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；,分子标记类型,现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。 一、基于分子杂交的分子标记这类标记利用限制性内切酶酶切及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用特异探针进行杂交，通过放射性自显影
2、或非同位素显色技术揭示DNA的多态性。 （一）限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） （二）小卫星DNA（Minisatellite DNA）,二、基于PCR技术的分子标记,随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR) 、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP )、ISSR（ inter-simple sequence repea
3、t ）,（1）随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD） RAPD是由Williams和Welsh（1990）同时发展起 来的一项新的建立于PCR实验基础上的检测基因组DNA多态性的遗传标记技术。 基本原理 该技术利用大量的、各不相同的，碱基顺序随机排列的寡聚单核苷酸链为引物(约810 个碱基) ，以待研究的基因组DNA片段为模板，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，可对基因组DNA进行多态性分析。,RAPD (random amplified polymorphic DNA）,RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它
4、在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3端相距在一定的长度范围内，就可以扩增出DNA片段。 一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。,若位点2处碱基发生改变，则,RAPD标记的主要特点有： （1）
5、不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息； （2） DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低； （3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术； （4）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子； （5）实验重复性较差，结果可靠性较低。 RAPD已在遗传图谱构建、种质资源分析、基因标记等方面得到了广泛的应用。,实验试剂,随机引物（5M） Taq 酶 10PCR Buffer dNTP 10mM,PCR体系,ddH2 O 16l 10PCR Buffer 2.5l MgCl2 2l dNTP (10mM) 2l Primer(5pM) 1l Taq 酶(2U/l) 0.5l DNA
6、(50ng) 1l TOTAL 25l 最后加一滴石蜡油密封，防止体系蒸发。,PCR程序,94预变性 2min 40 cycles 94变性 1min 36复性 1min 72延伸1min 72 延伸 10min 10 保存,取PCR产物加1.5l loading buffer，在2%琼脂糖凝胶电泳，100V稳压1小时。 电泳结束以后，拍照、观察。,RAPD引物对部分兰属物种的扩增电泳图片,RAPD -PCR扩增结果,ISSR (inter-simple sequence repeat),ISSR即简单序列重复间区 是Zietkeiwitcz等于1994年在微卫星技术基础上发展起来的一种新的分
7、子标记。 基本原理 真核生物广泛存在简单重复序列（simple sequence repeat，SSR），如（AT）n （GAC）n等。利用SSR设计引物，并在引物的的3端或5端加上2-4个随机核甘酸，以保证引物与基因组DNA中SSR的3端或5端结合，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。用来检测两个SSR之间的一段短DNA序列的差异。 所扩增的两个SSR区域之间的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。由于微卫星在基因组中广泛分布，且等位变异特别丰富，因而可以检测到高的多态性。,锚定ISSR-PC
8、R示意图,用重复序列(CA)n作单引物，在引物的5 端或3锚定1至数个碱基。,ISSR标记的主要特点,优点：ISSR 标记结合了RAPD 和SSR 的优点,所需DNA模板的量少、多态性丰富, 无需试剂盒、结果记录方便、实验成本低、操作简单、稳定性较高、呈孟德尔式遗传 缺点：是PCR 扩增时最适反应条件需要一定时间摸索, 其标记大多为显性标记, 在解决交配系统、计算杂合度和父系分析等问题时效果不佳,实验试剂,ISSR引物（5M） Taq 酶 (5U/l) 10PCR Buffer(含Mg2+ ) dNTP 10mM,PCR体系,ddH2 O 16l 10PCR Buffer 2.5l MgCl2
9、 2l dNTP (10mM) 2l Primer (5M) 1l Taq 酶(2U/l) 0.5l DNA(20ng) 1l TOTAL 25l 最后加一滴石蜡油密封，防止体系蒸发。,PCR程序,94预变性 7min 45cycles 94变性 30S 52复性 45S 72延伸 2min 72 延伸 10min 10 10min 保存,取PCR产物加1.5l loading buffer，在1.5%琼脂糖凝胶电泳，120V稳压0.5小时检测。 电泳结束以后，拍照、观察。,ISSR DNA-PCR扩增结果（示例）：,ISSR引物 U807对两种铁皮石斛的扩增结果 ISSR引物 U826对两种铁皮石斛的扩增结果,
