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1、,临床PCR实验室生物安全,1,outline,2,总论,凡是为预防、诊断、治疗任何人类疾病或损伤、或者评价人类健康而对人体的物质进行生物、微生物、血清化学、血液、生物物理、细胞或者其他类型检验的部门，统称为临床实验室,3,实验室每天要处理来自临床的标本，如血液、穿刺液、分泌物等，对这些“未知疾病标本”无法得知其危险程度，因此，每个临床实验室每天都面临生物安全隐患,4,真菌,病毒,细菌,临床实验室危害源,寄生虫,易燃性、 腐蚀性、 有毒性、 强酸性化学品等,电器设备、 辐射、 噪声等,5,生物源危害,来源： 临床实验室中处理的病人标本（细菌、病毒、真菌、寄生虫）,6,细菌（bacteria）,
2、结核杆菌 Mycobacterium tuberculosis. Rod-shaped Bacterium,白喉杆菌 Corynebacterium diphtheriae. Rod,clubed-shaped Bacterium (causes diphtheria),7,病毒 （viruses）,狂犬病病毒 Rabies,DNA肿瘤病毒 DNA tumor viruses,脊髓灰质炎病毒 polio,8,Harrington和Shannon在1976年的调查中发现，结核分枝杆菌、乙型肝炎病毒与志贺菌已成为英国临床实验室工作人员最为常见的职业性感染原因,9,临床实验室生物污染的原因及种类,空
3、气污染 水的污染 人体污染 物体表面的污染,10,空气污染,内： 平面布局、气流方向 合理 死角区域 缩小 外： 直接外排或扩散 高效过滤 密闭或压力差,11,水、人体、物体表面污染,实验过程中产生的大量污水 特殊处理后排放 工作人员实验室感染（接触、吸入） 专门防护规程 物体表面污染（溅出、溢出、穿用错误等） 正确操作,12,化学源危害,含义： 临床实验室内的部分化学品具有易燃、可燃、刺激、腐蚀性或剧毒性等危害,13,物理源危害,来源： 噪音 辐射 紫外线 电磁场 其他,14,实验室工作人员在实验过程中受到实验室生物污染而发生的感染,实验室感染,15,东北农大师生因动物实验感染严重传染病,2
4、010年12月，东北农业大学30名学生在实验室进行“羊活体解剖学实验”，因实验动物购买未按黑龙江省实验动物管理条例，未要求养殖场出具有关检疫合格证明， 使28人被感染布鲁氏菌病 布病 结核,16,2003年9月9日，新加坡一名患者被确诊感染了非典病毒。 这名27岁的男子是新加坡国立大学专门研究西尼罗病毒的微生物实验室的一名研究生。由11名专家组成的国际调查小组认为，不恰当的实验程序、以及西尼罗病毒样本与非典冠状病毒在实验室里的交叉感染，可能是这名患者感染非典病毒的原因,新加坡的实验室SARS感染事件,17,实验室感染的途径,空气传播：接种环、吸管、注射器使用时 经口传播 直接接种：针刺、划伤等
5、 黏膜接触：如HIV能通过眼结膜进入人体 节肢动物媒介（叮咬等）,18,消化道摄入传播,实验室感染的发生率(Britain) 志贺菌临床实验室感染 0.322 沙门菌临床实验室感染 0.137 其他肠道致病菌如弧菌属细菌、弯曲菌属细菌及大肠埃希菌等的实验室感染率极低,19,职业HIV感染,Occupationally acquired AIDS cases or HIV infections reported ti CDC through 1992 Occupation No. (%) of occupational transmissions Laboratory technician 25
6、(24.8) Nurse 26(25.7) Physician 13(12.8) Medical technician/paramedic 7(6.9) Dentist/dental technician 6(5.9) Health aide/attendant 6(5.9) Housekeeper/maintenance worker 6(5.9) Morgue technician 3(3.0) Technician/therapist 3(3.0) Respiratory therapist 2(2.0) Surgical technician 2(2.0) Other HCW 2(2.
7、0) Total 101 Adapted from D.L. Sewell, Clinical microbiology reviews,1995,389-405,20,临床实验室安全管理,硬件管理,实验室设备,个人防护设备,21,生物安全防护（biosafety containment）指在实验室环境下处理和保存感染性物质的过程中采用的一系列的防护措施，包括一级防防和二级防护,22,一级防护与二级防护,一级防护： 包括规范操作技术与规程，配置适当的安全设备，保护操作人员和室内直接环境免遭感染性物质的污染 二级防护： 包括合理的实验室设施设计和严格规范的操作流程，用以保护实验室外环境免受感染性
8、物质污染,23,个体防护装备,24,个体防护装备,装备 避免的危害 安全性特征 实验服、隔离衣、连体衣 污染衣服 背面开口 罩在日常服装外 鞋袜 碰撞和喷溅 不露脚趾 护目镜 碰撞和喷溅 防碰撞镜片 侧面有护罩 安全眼镜 碰撞 防碰撞镜片 侧面有护罩 面罩 碰撞和喷溅 罩住整个面部 发生意外时易于取下,25,个体防护装备,装备 避免的危害 安全性特征 防毒面具 吸入气溶胶 在设计上包括一次性使用的、整 个面部或一半面部空气净化 的、整个面部或加罩的动力空 气净化的以及供气的防毒面具 手套 直接接触微生物 得到微生物学认可的一次性乳 划破 胶、乙烯树脂或聚腈类材料 保护手 网孔结构,26,生物安
9、全柜,环境空气进入工作台过滤样本高效过滤排入室内或室外 采用负压装置，形成气幕防护屏障，保护操作人员安全,27,实验室分区,清洁区：包括办公室、休息室、培养基室等 半污染区：包括缓冲间、更衣室和卫生通道等 污染区：包括样本收集区、处理区、培养区和废弃物处理区等,28,实验室的出口和通道必须保持畅通无 阻，不准堆放物品、垃圾、装置或设备,出口通路,29,BSL-2级实验室生物安全,30,二级生物安全防护实验室安全操作规程,1.禁止非工作人员进入实验室。参观实验室等特殊情况须经实验室负责人批准后方可进入。 2.接触微生物或含有微生物的物品后，脱掉手套后和离开实验室前要洗手。 3.禁止在工作区饮食、
10、饮水、吸烟、处理隐形眼镜、化妆及储存食物。 4.以移液器吸取液体，禁止口吸。,31,32,33,34,35,二级生物安全防护实验室安全操作规程,5.制定尖锐器具的安全操作规程。 6.按照实验室安全规程操作，降低溅出和气溶胶的产生。 7.每天至少消毒一次工作台面，活性物质溅出后要随时消毒。 8.所有培养物、废弃物在运出实验室之前必须进行灭活，如高压灭活。需运出实验室灭活的物品必须放在专用密闭容器内。 9.制定有效的防鼠防虫措施。,36,二级生物安全防护实验室安全操作规程,10.实验室入口处须贴上生物危险标志,内部显著位置须贴上有关的生物危险信息,包括使用传染性材料的名称,负责人姓名和电话号码。
11、11.进行感染性实验时，禁止他人进入实验室，或必须经实验室负责人同意后方可进入。免疫耐受或正在使用免疫抑制剂的工作人员必须经实验室负责人同意方可在实验室或动物房内工作。,37,二级生物安全防护实验室安全操作规程,12. 实验室入口处须贴上生物危险标志，注明危险因子、生物安全级别、需要的免疫、负责人姓名和电话、进入实验室的特殊要求及离开实验室的程序。 13. 工作人员应接受必要的免疫接种和检测(如乙型肝炎疫苗、卡介苗等)。 14.并根据需要定期收集血清样本，应有检测报告，如有问题及时处理。,38,二级生物安全防护实验室安全操作规程,15.将生物安全程序纳入标准操作规范或生物安全手册，由实验室负责
12、人专门保管，工作人员在进入实验室之前要阅读规范并按照规范要求操作。 16.工作人员要接受有关的潜在危险知识的培训，掌握预防暴露以及暴露后的处理程序。每年要接受一次最新的培训。 17.严格遵守下列规定，防止利器损伤：,39,二级生物安全防护实验室安全操作规程,17.1 除特殊情况(肠道外注射和静脉切开等)外，禁止在实验室使用针、注射器及其他利器。尽可能使用塑料器材代替玻璃器材。 17.2 尽可能应用一次性注射器，用过的针头禁止折弯、剪断、折断、重新盖帽、从注射器取下，禁止用手直接操作。用过的针头必须直接放人防穿透的容器中。非一次性利器必须放入厚壁容器中并运送到特定区域消毒，最好进行高压消毒。 1
13、7.3 尽可能使用无针注射器和其他安全装置。 17.4 禁止用手处理破碎的玻璃器具。装有污染针、利器及破碎玻璃的容器在丢弃之前必须消毒。,40,二级生物安全防护实验室安全操作规程,18.培养基、组织、体液及其他具有潜在危险性的废弃物须放在防漏的容器中储存、运输及消毒灭菌。 19. 实验设备在运出修理或维护前必须进行消毒。 20. 人员暴露于感染性物质时，及时向实验室负责人汇报，并记录事故经过和处理方案 21. 禁止将无关动物带入实验室。,41,PCR实验室的生物安全,42,PCR技术的基本原理与PCR技术的特点,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),又称
14、无细胞分子克隆系统或体外酶促基因扩增法。PCR技术是由穆利斯 （Kary B Mullis）于1985年联合创造的。该技术可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品。,43,PCR技术的基本原理,其原理类似于DNA的天然复制过程，PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。 模板DNA的变性 模板DNA经加热至93左右一段时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； 模板DNA与引物的退火(复性) 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,44,PCR技术的基本原理,引物的延伸 DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性退火延伸三过程，就可获得更多的“半保留复
