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1、.,PCR原理及操作,.,主要内容,一、PCR技术的基本原理 二、PCR反应体系及反应条件 三、PCR在HLA-SBT中的策略 四、检测流程及操作注意事项 五、实验结果分析,.,PCR技术的基本原理,.,变性退火 延伸,.,二、PCR反应体系及反应条件,.,三、PCR在HLA-SBT中的策略,.,HLA Class I (A, B and C) SBT:,HLA Class II (DRB1 , DQB1) SBT:,.,常规HLA配型位点信息,.,PCR反应参数的设置,.,四、检测流程及操作注意事项,.,MIX 配制,配制MIX前先将所需的试剂准备好，使用前振荡并离心。 将移液器、枪头等实验
2、用品按要求摆放整齐,.,MIX的配制中酶最后加入。 为防止漏加或重复加样，每加入一种试剂后，在该试剂用量数字后打勾做标记。,.,模板分装,根据PCR反应表所编的模板位置来编排相应的PCR板。 加模板前将DNA振荡离心，按照对应的DNA条码号在离心管架上排列好存放模板的离心管的顺序，并复核一遍，以确保模板顺序与PCR反应表一致。 样品应加到反应孔底部，并注意不同样品要换枪头。 加完样品后检查是否加错或漏加,.,MIX分装,反应板上所标的位点选择相应的MIX； 加MIX时移液器保持垂直，加同样的MIX时可不更换枪头； 若枪头尖端有较多试剂悬挂，应让枪头贴壁后更换新枪头，防止接触到模板而造成污染;
3、分装完成后，从孔板底部观察是否有漏孔，若有漏加应选用相应位点的MIX补加; 胶垫方向与反应板一致，列数编号对应。,.,电泳,.,五、实验结果分析,（1）不出现扩增条带 原因： 1、模板质量（含有抑制物，浓度纯度低） 2、引物质量（错配，引物降解） 3、人为原因（体系错配，扩增程序有误） 对策： 1、纯化模板或重提或加大模板用量 2、更换新引物 3、重做,.,（2）出现非特异性扩增带,原因： 1、引物特异性差 2、模板或引物浓度过高 3、酶的质量差或量过高 4、Mg2+浓度过高 5、退火温度偏低 6、循环次数过多 对策： 1、重新设计引物 2、降低模板或引物浓度 3、减少酶量，更换另一种酶 4、
4、降低Mg2+浓度 5、提高退火温度 6、减少循环次数,.,（3）出现片状拖带或涂抹带,原因： 1、模板不纯 2、buffer不合适 3、退火温度偏低 4、酶量过多 5、dNTP、Mg2+浓度偏高 6、循环次数过多,对策： 1、纯化模板 2、更换buffer 3、适当提高退火温度 4、适量用酶 5、适当降低dNTP、Mg2+浓度 6、减少循环次数,.,PCR操作中出现的错误、原因及后果,.,PCR操作中出现的错误、原因及后果,.,由于PCR方法高度灵敏，少量的靶分子即可扩增至无限数。因此要防止PCR扩增产物污染环境而影响实验结果。 实验前后都要做好清洁工作，如实验前桌面用清水酒精擦拭，实验后擦次氯酸钠，照紫外，通风，垃圾处理等。,注意事项,.,注意事项,检查程序 上机前要检查程序是否有更改。 上样 要保持在同一高度上，保证受热均一以避免边缘效应。 热盖 应压紧以免硅胶垫不紧导致样品蒸干，但不可拧得过紧导致反应管变形。,
