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1、HPLC及HPLC/MS分析方法的开发及其在药物分析中的应用,2,基于分离分析科学技术 小颗粒填料的色谱柱 以光谱、质谱技术作为检测手段 专属性、分离效率及灵敏度 适用于广泛的色谱应用 适用于开发新方法 适用于现有方法的改进,HPLC及HPLC/MS法,3,质量源于设计（Quality by Design，QbD）准则 实验设计方法学 （Design of Experiment，DoE） 方法验证（Method Validation）：确保方法在样品分析的一定范围内中准确、重现、可靠、耐用性。,分析方法学的开发及验证,4,方法开发,实验室获得方法及运用过程,方法验证,方法确认,方法转移,准确度
2、，精密度，专属性，检测限，定量限，线性，范围，耐用性,分析条件的筛选（色谱柱,流动相,pH等）及优化（梯度、柱温、流速等）,法定检验方法在使用环境中适用性评估（人员、仪器、样品、试剂）,非法定检验方法在实验室之间传递的文件化过程,5,实验室获得方法及运用过程,方法验证,方法确认,- 用一个性质明确的物质来挑战建立的分析方法,用一个确定方法来挑战现实的分析环境 专属性，准确度，精密度，LOD，LOQ 一般不需要进行线性，范围，耐用性实验,6,ICH、USP、ChP II Appendix XIX A,方法验证的内容,准确度（Accuracy） 精密度（Precision）-重复性，重现性，中检精
3、密度 专属性（Specificity） 检测限（LOD） 定量限（LOQ） 线性（Linearity） 范围（Range） 耐用性（Robustness）,7,方法验证-系统适用性,系统适用性试验的内容 在分析未知样品之前或期间，检查系统以保证系统之性能达到规定的要求 塔板数，拖尾因子，分离度 确定重现性（%RSD） 系统适用性“样品” 主组份与预期副产物之混合物 系统适用性试验是色谱方法的一部分,8,方法验证-系统适用性,容量因子 k 2 精密度/进样重复性 RSD 1%, n 5 分离度 Rs 2 (主峰与最近洗脱的色谱峰之间),拖尾因子 T 2 理论塔板数 通常 N 2000,9,方法验
4、证- USP,类型1 主组份或活性成份定量分析方法 类型2 杂质或降解化合物测定方法 类型3 性能特点之确定分析方法 如溶出度实验 类型4 鉴别试验,10,方法验证- USP,* 可能需要，具体与特定试验的性质有关。,11,如何进行方法验证,分析实验阶段 按照规定的实验计划或步骤 通常需要3 到 5天 在不同操作条件下，进不同浓度的试样 原料及制剂皆需分析 数据分析阶段 对分析结果进行统计学计算 色谱结果是相对的 用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真实变化,12,方法验证步骤,线性 Day 1-3,定量限,检测限,实验参数 2 Min 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用,O-,Si
5、,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,当流动相pH值小于3时, 硅醇基趋于中性(未解离),Base,Base,对碱性化合物的保留及严重拖尾,两实验使用相同的传统C8硅胶柱,离子交换作用,当流动相为 pH6-8时, 硅醇基带负电性(大部解离),碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理,26,固定相,低pH可能导致分离度降低或根本不能分离！,27,固定相,未浸润的
6、孔,浸润的孔,注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，降低被分析物的保留时间即等于“丧失浸润”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！,低有机溶剂或纯水溶液流动相,C18 硅胶,28,固定相,Minutes,流动相：0.1% 醋酸水溶液,阿莫西林,Vo：被分析物没有保留,起始：填料完全浸润 “Wetted”,停止流速后： 填料完全脱离浸润状态 “De-Wetted”,丧失浸润现象：100%水溶液中保留完全丧失,29,流动相,甲醇 质子化溶剂 氢键供给者 洗脱能力较乙腈弱 粘度较乙腈高 低紫外波长下有吸收 乙腈 非质子化溶剂 氢键接受者
7、洗脱能力较甲醇强 粘度较甲醇低 低紫外波长下透光性好,30,流动相,Jenkins, Diehl,RP18Low pH (pH 3),100% MeOH,100% ACN,1:1 ACN:MeOH,1,2,4,3,5,6,2,8,7,9,6,10,12,11,8,9,10,11,10,11,12,12,8,9,1,6,7,2,3,4,4,3,1,5,7,5,1. Gentisic acid (A) 2. Caffeine (WB) 3. Ritodrine (B) 4. Hydroguinidine (B) 5. 1-Pyrenesulfonic acid (A) 6. Imipramine
8、(B) 7. Amitriptyline (B) 8. Flavone (N) 9. 4-Dimethylamino-benzophenone (WB) 10. Diclofenac (WA) 11. Dioseb (A) 12. Octanophenone (N),31,流动相pH值,影响带有可离子化官能团的分析物 胺 羧基 酚 有些化合物含有一个以上的可离子化官能团 改变流动相pH将使选择性发生极大改变,32,流动相pH值,酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大 中性化合物的保留不受pH影响,Silica pH Range,Hybrid Particle pH Range,Neue
9、 et. al. American Laboratory 1999 (22) 36-39.,33,固定相、溶剂和流动相pH的影响因素,I,A,P,Fl,Fe,D,O,Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH,P,C18 pH 3, ACN,I,A,P,Fl,Fe,D,O,I,A,Fl,Fe,D,O,C18 pH 10, ACN,Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH,Test Probes: I: Imipramine B A: Amitriptyline B Fl: Flavone N O: Octanophenone N,碱性及中性化合物,34,固定相、溶剂和流动相pH的
10、影响因素,I,A,P,Fl,Fe,D,O,Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH,P,C18 pH 3, ACN,I,A,P,Fl,Fe,D,O,I,A,Fl,Fe,D,O,C18 pH 10, ACN,Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH,Test Probes: P: 1-pyrenesulfonic acid A Fe: fenoprofen A D: diclofenac A,酸性化合物,35,固定相、溶剂和流动相pH的影响因素,分析物在其未电离中性状态时保留较强 甲醇的洗脱能力较乙腈弱，因此所有化合物的保留都会得到增强，同时也具有不同于乙腈的选择性 当流动相pH
11、值能改变分析物的带电状态时，能得到选择性的极大改变 在任一条件下，使用不同固定相时，能获得大的选择性改变 最显著的选择性差异在于将固定相、溶剂和流动相pH因素综合时,36,梯度洗脱,优点 单位时间的分离能力增加较大的峰容量 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式 色谱柱需再生 定量分析的重复性较低,37,梯度洗脱,高压梯度及低压梯度,溶剂 A,溶剂 B,泵 A,泵 B,混合器,A 高压梯度,溶剂 A,泵,溶剂 B,比例阀（溶剂混合点）,混合器,B 低压梯度,（溶剂混合点）,38,梯度洗脱滞后体积,注意滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路！,39,滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如：滞后体积为 2.0ml，流速1.0ml/min时梯度晚2分钟 如流速为0.1ml/min，实际梯度晚20分钟 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献值大或小都使方法不能重现 普通HPLC的滞后体积为24ml 对分析型HPLC没有影响 对作微柱实验用梯度时影响较大,梯度洗脱滞后体积,40,液相色谱的分离机理,从色谱方法上分 正相 / 反相 离子交换 分子体积排除 亲合 疏水回受,从柱子类型上分 分配 / 吸附 离子交换 凝胶 亲合,
