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1、1,第三章 蛋白质的修饰和表达,蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重组蛋白质的表达进行讲解。,2,第一节 蛋白质修饰的化学途径,蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改变的过程。 有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学活性，这些修饰称为非必需部分的修饰。但多数情况下，蛋白质结构的改变将导致生物活性的改变。,3,影响化学修饰的主要因素有两方面： 1、蛋白质功能基的活性反应，包括基团之间的氢键和静电作用等，基团之间的的空间阻力。 2、修饰剂的反应活性。,4,一、蛋白质侧链的化学修饰,在
2、20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基和羧基特别容易产生有用的取代。 因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。至于谈到氨基和羧基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在化学上很难将肽链的-氨基或-羧基基团与侧链上的氨基或羧基相区别。,5,蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。,6,（一）巯基的化学修饰 由于巯基有很强的亲核性，巯基基团一般是蛋白质分子中最容易反应的侧
3、链基团。 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸测序前，常用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化，以防止半胱氨酸的降解。 其他一些卤代酸、卤代酰胺也可以修饰巯基。 N-乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修饰试剂，该反应具有较强的专一性并伴随光吸收的变化。,7,5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反应程度。,8,（二）氨基的化学修饰 赖氨酸的-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高
4、的基团，是蛋白质或多肽分子比较容易与修饰剂发生作用的位点。 常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等。,9,（三）羧基的化学修饰 谷氨酸、天冬氨酸 修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺类。,10,（四）二硫键的化学修饰 一般用变性剂如巯基乙醇，将二硫键还原成游离的巯基，再通过巯基修饰的方法对其进行修饰，如经过羧甲基化处理，以防止重新氧化成二硫键。,11,（五）其他侧链基团的修饰 1、组氨酸残基的咪唑基可以通过氮原子的烷基化或碳原子的亲核取代来进行修饰。,12,2、酪氨酸残基的修饰既可以是酚羟基的修饰，也可以是芳香环上的取代反应。,13,3、精氨酸残基含一个胍基，精氨酸残基
5、的强碱性，使其很难与大多数试剂发生修饰反应，但可以和二羰基化合物发生反应。,14,4、色氨酸吲哚基可以发生取代反应或者被氧化裂解。N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以使吲哚基团氧化成羟吲哚衍生物，但专一性较差，酪氨酸残基也可与该试剂发生反应。,15,5、蛋氨酸主要是由于硫醚的硫原子的亲核性所引起的，一些氧化剂可以使蛋氨酸氧化。,16,二、蛋白质的位点专一性修饰,专一性包括两方面的含义：一是试剂对被修饰基团的专一性；二是试剂对蛋白质分子中被修饰部位，如膜蛋白质上的激素结合部位、酶的活性部位等位点的专一性，一般这类试剂不仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专一性。这类专一性的化学修饰，称
6、为亲和标记或专一性的不可逆抑制作用。这类修饰试剂也被称为位点专一性抑制剂。,17,（一）亲和标记 亲和标记是一类位点专一性的化学修饰，试剂可以专一性标记于酶的活性部位上，使酶不可逆的失活，因此又称为专一性的不可逆抑制作用。,18,这类抑制剂可分为两类： 一类是Ks型的不可逆抑制剂，它是根据底物的结构设计的，它具有和底物结构相似的结合集团，同时还具有和活性部位氨基酸残基的侧链基团反应的活性基团。,19,另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶催化过程设计的。这类抑制剂具有和底物类似的结构，具有被酶催化和结合的性质。此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而活化，对
7、活性部位起不可逆抑制作用。这类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性底物”。,20,（二）光亲和标记 这类试剂在结构上除了有一般亲和试剂的特点外，还具有一个光反应基团。 反应一般分两步进行：第一步，试剂先与蛋白质的活性部位在暗条件下发生特异性结合；第二步，光照，试剂被光激活后，产生一个高度活泼的功能基团，与活性部位的侧链基团发生反应。,21,三、蛋白质的聚乙二醇修饰,聚乙二醇（PEG）由环氧乙烷聚合而成，两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到单甲氧基聚乙二醇（mPEG）。蛋白质修饰中应用最多的是mPEG的衍生物。,22,PEG与蛋白质的非必需基团共价结合时，可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原
8、决定簇，避免抗体产生，或者阻止抗原与抗体的结合而抑制免疫反应的发生。 还可以保护蛋白质不易被蛋白酶水解。 修饰后，分子量增加，肾小球滤过减少。 这些均有助于蛋白质类药物循环半衰期的延长。,23,修饰时，先对PEG进行活化，活化的PEG可与蛋白质分子侧链上的各种化学基团反应而与蛋白质相偶联，蛋白质分子上与PEG进行偶联的基团主要是氨基、巯基和羧基。,24,四、蛋白质的化学交联和化学偶联,化学交联可以发生于分子内的亚基与亚基之间，也可以发生与蛋白质分子与分子之间，也可以发生于蛋白质分子与分子之间，也可发生于多个分子之间，而形成网状交联。交联剂为含有双功能基团的化学试剂。如戊二醛 蛋白质的化学偶联是
9、指将蛋白质分子偶联到一个化学惰性的水不溶性载体上，形成固定化蛋白质。,25,蛋白质分子的固定化,蛋白质分子的固定主要是酶分子的固定。 酶的固定化，使用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。 优点：1、既能保持酶的活性又能克服游离酶的一些不足，提高酶分子的稳定性。 2、能与产物分开，有效地控制生产过程 3、能与产物分开，可省去热处理使酶失活的步骤，简化生产工艺 4、酶可在生产中重复利用，提高了酶的利用率。,26,酶的固定化可通过吸附法、交联法、包埋法、共价结合法去实现。 1、交联法 是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶
10、分子与载体间进行交联反应，把酶分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。 常用的交联剂是戊二醛和双重氮联苯胺 -2，2-二磺酸。,27,交联法有四种形式：1）酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。2）酶辅助蛋白交联法：酶量有限时，使酶与惰性蛋白共交联的方法。3）吸附交联法：先将 酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。4）载体交联法：用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能集团偶联酶蛋白。,28,2、共价结合法 是酶蛋白分子上功能团和固定支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接
11、，以固定酶的方法。 常用载体为：天然高分子（纤维素、琼脂糖、淀粉等），合成高聚物（尼龙、多聚氨基酸），无机支持物（多孔玻璃）,29,影响因素：1）要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团 2）反应必须在温和pH、中度离子强度和低温缓冲液中进行 3）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其他功能基团副反应尽可能少 4）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。,30,第二节 蛋白质的分子生物学改造,蛋白质的分子生物学改造主要有基因突变、基因融合和掺入非天然氨基酸等方法。,31,一、基因突变技术,基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋
12、白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。 根据改造策略的不同可以分为定点突变和定向进化两种，前者属于理性的设计方法，后者属于非理性的设计方法。,32,（一）定点突变 对已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入。 具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。 野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发，而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等。,33,1、重叠延伸PCR技术 由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的
13、扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。,34,35,为提高葡萄糖异构酶的热稳定性，用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点突变，以Pro138替代Gly138，突变性葡萄糖异构酶的热半衰期比野生型涨一倍，最是反应温度提高10-12度。,36,2、快速定点突变 首先准备质粒：必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。 然后，设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环。)正反向引物的延
14、伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。 再用DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。,37,（二）定向进化 在实验室中模仿自然进化的关键步骤突变、重组和筛选，在较短的时间内完成漫长的自然进化过程，有效的改造蛋白质，使之适于人类的需要。，这种策略只针对特定蛋白质的特定性质，因而被称为定向进化。 需要两项支撑技术，一是产生大量突变体为进一步筛选提供丰富的素材；二是有合适的筛选系统，可迅速从突变题库中筛选到符合目标的蛋白质。
15、,38,1、制造突变体,（1）易错PCR 基本原理是通过改变正常PCR反应体系中某些组分的数量或质量，随机引入错误碱基从而创造序列多样性的DNA序列文库。 关键在于选择适当的突变频率。一般目标基因内有1.5-5个碱基发生碱基替换时，诱变结果最理想。 由于一轮易错PCR往往很难获得满意的结果，因此常用连续易错PCR方法。,39,DNA shuffling allows accelerated evolution of genes,40,2、筛选,（1）表型观察选择和筛选 菌落分泌的蛋白酶可在含酪蛋白的琼脂平板上产生清晰的水解圈。 在高温并有蓝色木聚糖底物存在的条件下，根据菌落周围地物的颜色变化来
16、筛选耐高温的木聚糖酶。,41,（2）高通量筛选方法 噬菌体展示技术、细菌展示技术、酵母菌展示技术、核糖体展示技术、酵母双杂交系统等。,42,噬菌体展示技术 是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术。,43,Phage display method (1),M13 (a filamentous phage containing ss-DNA encased in a protein coat): contains five coat proteins, two of which are gVIIIp (gene VIII protein) and gIIIp (gene III protein).,44,Phage display method (2),45,Phage display method (2): (contd.),46,核糖体展示技术和mRNA展示技术在体外无细胞翻译体系中进行，用mRNA的可复制性，使靶基因得到有效富集，不受细胞转化效率的限制。大大提高了筛选通量。,47,二、基因融合和基因剪接
