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1、1,实验四 植物叶片活细胞和叶绿体的分离提取及观察,College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity,2,一、实验目的,初步掌握运用机械法分离活细胞和细胞器的方法； 掌握运用差速离心或密度梯度离心分离纯化叶肉细胞，细胞核，叶绿体的方法； 掌握分离的细胞的活性鉴别方法； 熟悉叶肉细胞或原生质体、细胞核、叶绿体的形态大小。,3,二、实验原理,细胞器的分离是研究细胞器的结构、功能和化学组成的技术基础，保持分离的细胞器的纯度、结构完整及其生理、生化活性是本实验的三大要素。细胞核是植物细胞中最大、最重要的细胞器，使细胞各种生命活动的指
2、挥中心。叶绿体是植物细胞进行光合作用，将光能转变成化学能的重要细胞器。由于它们的重要功能，所以它们一直是细胞生物学、遗传学、和分子生物学研究的重要对象。利用离心技术可分离、纯化细胞、细胞核和叶绿体。,4,将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离各种细胞器的常用方法。颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，一定时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同，依次增加离心力和离心时间，能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分，最先沉淀的是细胞，其次是细胞核，接下来是叶绿体。
3、 悬浮介质通常用缓冲的等渗溶液，它与细胞质的分散相接近，在一定程度上能保持细胞器的真实结构和酶的活性。,二、实验原理,5,6,7,三、实验用具和试剂,1仪器：组织捣碎机、高速冷冻离心机、托盘天平、 普通光学显微镜、剪刀、培养皿、250ml烧杯、量 筒、玻璃漏斗、移液管、离心管、滴管、滤纸、 纱布一大块或400目尼龙网、载玻片、盖玻片。 2试剂： SNT溶液：0.4M蔗糖、0.01M NaCl 0.05M Tris-HCL缓冲液 ： 0.2M Tris（三羟甲基氨基甲烷） 50ml 0.1N HCL 50-55ml 两液混匀后，加蒸馏水至200ml，pH7.6,8, 1/3000中性红染液: 称
4、取0.5中性红溶于50ml Ringer溶液，稍加热（30400C）使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。 临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。 香柏油 3材料：新鲜菠菜,三、实验用具和试剂,9,四、实验内容,1组织匀浆液的制备（组织捣碎法）。 2细胞及细胞器（细胞核、叶绿体等）的分 离、纯化（离心分离法）。 3细胞、细胞核、叶绿体的镜检（根据形态、 大小、分布位置、数量识别法）。 4分离细胞活性的鉴别（中性红活体染色 法）。,10,五、实验方法和步骤,1取材：取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后，除 叶梗
5、及粗脉，剪成0.5x0.5cm小块。 2匀浆：将称取60g叶片小块放入组织捣碎机套 筒内，加入200ml SNT溶液，匀浆20秒(最高 速度)制成匀浆液。 3过滤：将匀浆液经四层纱布过滤，或400目尼 龙网过滤，滤液分装离心管，平衡。,11,4离心： 滤液 200g（1000rpm/分）1分 _ 沉淀1 上清,平衡,离心 （含叶肉细胞） 500g（1500rpm/分）1分 沉淀2（含细胞核） 上清,平衡,离心 1000g（3000rpm/分）5分 沉淀3 上清，弃 （含大量叶绿体）,12,5悬浮：分别收集沉淀，用少量的SNT溶液 分别将沉淀1、2、3悬浮。 6镜检： 取悬浮液1、2分别做滴片镜
6、检。 然后加几滴中性红染色5-10min，盖 上盖玻片镜检。 取悬浮液3做滴片盖上盖玻片，用油镜 观察。,13,六、实验结果,1在普通光学显微镜下，在悬浮液1滴片中可以看到含细胞核和大量叶绿体的叶肉细胞（形态为球形或椭圆形的原生质体）。 2在普通光学显微镜下，在悬浮液2滴片中可以看到细胞核（形态为球形）。 3在普通光学下，在悬浮液1、2滴片中性红染色可以鉴别活细胞及细胞核（中性红是液泡系特殊的活体染色剂，在细胞处于生活状态时，中性红只将液泡染成红色，而细胞质及细胞核不着色。如果细胞死亡，红色会弥散在整个细胞中）。 4在普通光学显微镜下，在悬浮液3滴片中可以看到叶绿体（叶绿体为绿色椭圆形，在高倍
7、镜下可以看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒）。,14,七、实验注意事项,1细胞和各种细胞器的分离应在等渗溶液中进行，以免渗透压的改变使细胞和细胞器的受到损伤。 2要注意整个实验的分离过程必须在05的条件下进行，避免酶的失活；如果在室温下，要迅速分离和观察。 3离心过程中要注意离心力和离心时间。,得到结构真实、完整并具生理、生化活性的细胞器应注意的问题？,15,八、实验作业,1.绘制出一个完整的叶肉细胞图（内含细胞核、叶绿体）。 2.得到结构真实、完整并具生理、生化活性的细胞器应注意哪些问题？谈谈SNT溶液中的各种成分的作用。 3.分离各种细胞器所需的相对离心力与哪些因素有关？ 4.对你设计的实验的成败谈谈感想，提出改进的措施。 5.做哪些研究需要分离制备叶绿体？,16,叶肉细胞,17,细胞核,18,活细胞及细胞核,19,叶绿体,20,绘图参考,提示：下次实验为 实验五 细胞膜的通透性 实验六 细胞凝集反应,
