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1、课题3 血红蛋白的提取和分离,专题5 DNA和蛋白质技术,一、基础知识-蛋白质提取和分离原理,蛋白质提取与分离的依据蛋白质的物理化学性质：,形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、 亲和力等千差万别。,（1）原理： （2）材料,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。,多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。,(一)凝胶色谱法,（3）分离过程,洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。,(一)凝胶色谱法,(一)凝胶色谱法, 凝胶色谱法（分配色谱法）：,1、什么是凝胶？,2、什么是凝胶色谱法？,学生活动2:,3、凝胶
2、色谱法的原理是什么？,4、请用自己的话总结出凝胶色谱法分离相对分子质量不同蛋白质的具体过程。,由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠，NaH2PO4/Na2HPO4等,缓冲溶液洗脱剂 组成： 配制： 作用：,调节缓冲剂的比例，可配制不同pH的缓冲液。,抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。,（二）、缓冲溶液,1 、什么是电泳？,2、 影响电泳迁移速度的因素有哪些？,学生活动4:,4、电泳分离各种分子的原理是什么？,（三）、电泳,3、 如何消除电荷对电泳迁移速度的影响？,5 、请描述电泳的过程？,2凝胶电泳法：,（1）原理：,不同蛋白质的带电性质、电量、
3、形状和大小不同， 在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同， 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,影响蛋白质分子运动速度的因素,(三)电泳,1.电泳的概念,指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.,影响蛋白质分子运动速度的因素,在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电； 加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。,（2）分离方法： （3）分离过程：,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,(三)电泳,二、实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集到的血红蛋白溶液。 （2）
4、粗分离：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,（一）样品处理,1、红细胞的洗涤： 目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。 2、血红蛋白的释放： 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放 3、分离血红蛋白溶液： 离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。 4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。,二、实验操作,血液组成成分,阅读思考： 血液由_和_两部分组成。 血细胞中_细胞数量最多，红细胞的含量最高的有机
5、化合物是_。 该化合物是由 _和_构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的_基团。,课题3 血红蛋白的提取与分离,返回,1.洗 涤 红 细 胞,阅读思考：洗涤的目的是什么？ 洗涤过程：,血液 100mL,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,课题3 血红蛋白的提取与分离,初次离心后的结果,3次洗涤后的结果,返回,2.释放血红蛋白,阅读思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？ 为了加速释放过程，采取了什么措施？,目的分析： 蒸馏水的作用是_。 加入甲苯的作用是_。 充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,课题3 血红蛋白的提
6、取与分离,(2)血红蛋白的释放：,加蒸馏水到原血液体积，再加40体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。,3.分离血红蛋白,分离过程,红细胞 混合液,烧杯,课题3 血红蛋白的提取与分离,(3)分离血红蛋白溶液：,过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，
7、分出下层的红色透明液体。,甲苯层（无色透明）,白色薄层固体,红色透明液体,杂质沉淀层（暗红色）,试管中溶液层次,返回,课题3 血红蛋白的提取与分离,4.透析血红蛋白,利用透析袋透析,课题3 血红蛋白的提取与分离,纯化凝胶色谱操作,1.凝胶色谱柱的制作：,2.凝胶色谱柱的装填：,教材图519,3.样品的加入和洗脱,（二）凝胶色谱操作,（1）凝胶色谱柱的制作： 取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体
8、残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。,材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液 装填:,课题3 血红蛋白的提取与分离,2.凝胶色谱柱的装填：,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒洗脱液沸水浴,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得
9、水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 凝胶的前处理：配制凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、洗脱液面不要低
10、于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,3.样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流
11、出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,3.样品的加入和洗脱,3.样品加入与洗脱,注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,收集得到的纯化后的血红蛋白,课题3 血红蛋白的提取与分离,注意事项,1. 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2. 凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 3. 色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 4.
12、 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、实验结果分析与评价,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,三、实验结果分析与评价,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,三、实验结果分析与评价,
