毛细管电泳法测定针剂中亚硫酸氢钠甲萘醌的含量

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1、毛 细 管 电 泳 法 测 定 针 剂 中 亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 的 含 量唐 亚 军 1, 2 吴 明 嘉 3 11 (中 国 科 学 院 长 春 应 用 化 学 研 究 所 国 家 电 化 学 和 光 谱 分 析 研 究 中 心 ,长 春 130022)2 (中 国 科 学 院 研 究 生 院 ,北 京 100039)摘 要 建 立 了 亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 的 高 效 毛 细 管 电 泳 紫 外 测 定 方 法 。 以 未 涂 层 融 硅 石 英 毛 细 管 (55 cm 75 m)为 分 离 柱 , 40 mmol/L磷 酸 盐 + 50 mmol/L SDS(pH

2、 = 7. 5)为 电 泳 介 质 ,在 分 离 电 压 为 15 kV,紫 外 检 测 波长 为 231 nm的 条 件 下 对 亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 进 行 测 定 。 讨 论 了 缓 冲 溶 液 、 pH值 的 选 择 ,并 着 重 研 究 了 十 二 烷基 硫 酸 钠 对 亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 增 溶 作 用 机 理 。 以 磷 酸 吡 哆 醛 为 内 标 对 亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 注 射 液 进 行 测 定 ,方 法 简 单 可 行 且 结 果 良 好 。关 键 词 毛 细 管 电 泳 ,亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 ,十 二 烷 基 硫 酸 钠200

3、4204224收 稿 ; 2004208209接 受1 引 言维 生 素 K3 是 根 据 天 然 K1 和 K2 的 母 核 22甲 基 21, 42萘 醌 的 结 构 由 人 工 合 成 而 得 ,主 要 用 于 维 生 素缺 乏 症 ,具 有 促 进 凝 血 因 子 的 合 成 和 提 高 凝 血 活 酶 的 活 性 的 作 用 ,可 预 防 继 发 性 凝 血 酶 原 缺 乏 症 ,亦 具有 镇 痛 和 解 痉 作 用 ,现 已 广 泛 地 应 用 在 医 药 和 饲 料 中 1 。 因 22甲 基 21, 42萘 醌 难 溶 于 水 ,故 将 维 生 素 K3制 成 其 亚 硫 酸

4、氢 钠 的 加 成 物 。 测 定 亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 的 方 法 有 荧 光 检 测 法 2 4 、 化 学 发 光 法 5 、 极 谱法 6 及 高 效 液 相 色 谱 法 7, 8 。 这 些 方 法 在 测 定 过 程 中 为 了 增 加 亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 的 溶 解 能 力 ,都 使 用了 有 机 溶 剂 。 与 以 上 检 测 方 法 相 比 ,毛 细 管 电 泳 具 有 高 灵 敏 度 、 高 分 辨 率 、 高 速 度 、 低 成 本 、 低 耗 样 及 应用 范 围 广 等 优 点 9 ,而 且 可 以 采 用 水 体 系 而 不 使 用 有 机 试

5、 剂 。 本 实 验 采 用 高 效 毛 细 管 电 泳 紫 外 测 定 方法 ,以 40 mmol/L磷 酸 盐 + 50 mmol/L SDS(pH = 7. 5)为 电 泳 介 质 ,建 立 了 针 剂 中 亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 的测 定 方 法 ,取 得 了 满 意 的 结 果 。2 实 验 部 分2. 1 仪 器 和 试 剂采 用 自 组 装 的 毛 细 管 电 泳 仪 ;极 性 可 调 高 压 电 源 (上 海 原 子 核 研 究 所 ) ;多 波 长 紫 外 检 测 器 (美 国ISCO公 司 ) ; N2000色 谱 工 作 站 (浙 江 大 学 智 能 信 息 工

6、程 研 究 所 ) ; PHS23CT型 酸 度 计 (上 海 大 中 分 析 仪器 厂 ) , 75 m 360 m 的 毛 细 管 (河 北 永 年 光 导 纤 维 厂 ) ,总 长 55 cm,有 效 长 度 40 cm ,紫 外 检 测 波 长231 nm。 甲 萘 醌 (menadione,中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 ) ;磷 酸 吡 哆 醛 (pyridoxal 52phosphate, Sigma公司 ) ;亚 硫 酸 氢 钠 ;亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 注 射 液 (menadione sodium bifulfite injection,无 锡 市 第

7、七 制 药 有 限 公司 ) ;十 二 烷 基 硫 酸 钠 ( sodium dodecylsulfate, 淄 博 俱 进 化 工 有 限 公 司 ) ; Na2 HPO4 (北 京 市 红 星 化 工 厂 ) ;H3 PO4 (北 京 化 工 厂 ) ; NaOH ( sodium hydroxide,北 京 化 工 厂 )。 所 用 试 剂 均 为 分 析 纯 ,水 为 二 次 蒸 馏 水 。2. 2 缓 冲 溶 液 和 样 品 溶 液分 别 配 制 以 下 浓 度 的 储 备 液 : 200 mmol/L Na2 HPO4 ; 100 mmol/L H3 PO4 ; 100 mmol/

8、L的 十 二 烷 基 硫酸 钠 。 实 验 时 ,按 比 例 各 取 适 量 以 制 得 不 同 浓 度 和 不 同 pH值 的 电 泳 运 行 缓 冲 液 。 精 确 称 取 甲 萘 醌 25mg和 亚 硫 酸 氢 钠 15 mg,加 热 溶 解 后 定 容 于 5 mL的 棕 色 容 量 瓶 中 ,进 样 时 用 缓 冲 液 稀 释 到 所 需 浓 度 。2. 3 实 验 方 法毛 细 管 柱 在 使 用 前 依 次 用 0. 1mol/L NaOH、 二 次 蒸 馏 水 和 运 行 液 各 冲 洗 约 5 m in。 更 换 运 行 液 或 每进 样 4次 后 也 需 按 上 述 步 骤

9、 清 洗 毛 细 管 。 实 验 采 用 虹 吸 进 样 ,进 样 高 度 差 为 6. 5 cm,进 样 时 间 为 8 s,分第 33卷2005年 6月分 析 化 学( FENX I HUAXUE) 研 究 简 报Chinese Journal of Analytical Chem istry第 6期828 830离 电 压 为 15 kV ,实 验 在 恒 温 ( 25 ) ,恒 湿 ( 40% )的 实 验 条 件 下 进 行 ,所 有 试 剂 和 样 品 在 使 用 前 均 用0145 m的 醋 酸 纤 维 素 膜 (江 苏 麒 麟 医 用 仪 器 厂 )过 滤 。3 结 果 和 讨

10、 论3. 1 缓 冲 溶 液 和 pH的 选 择醌 的 环 经 物 理 方 法 及 化 学 方 法 证 明 不 是 苯 环 ,它 具 有 , 2不 饱 和 酮 的 性 质 。 醌 分 子 是 一 个 强 的 电子 受 体 ,通 过 在 分 子 内 引 入 适 当 的 给 体 和 强 的 受 体 ,使 它 具 有 分 子 内 电 荷 转 移 化 合 物 的 性 质 ,吸 收 从 可见 区 移 到 红 外 区 ,既 能 与 亲 电 试 剂 发 生 亲 电 加 成 ,也 能 与 亲 核 试 剂 发 生 亲 核 加 成 ,因 此 在 实 验 中 必 须 选择 合 适 的 缓 冲 溶 液 。 亚 硫 酸

11、 氢 钠 甲 萘 醌 在 柠 檬 酸 三 钠 缓 冲 溶 液 中 没 有 响 应 ,而 在 硼 砂 缓 冲 液 和 磷 酸 盐缓 冲 溶 液 中 均 有 响 应 。 但 是 在 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液 中 基 线 稳 定 ,峰 形 对 称 ,灵 敏 度 较 高 。 因 此 选 择 磷 酸 盐 缓冲 体 系 。 在 酸 性 环 境 中 ,亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 不 稳 定 ,容 易 发 生 异 构 化 ,而 在 弱 碱 性 环 境 中 比 较 稳 定 。 本实 验 中 选 择 pH值 为 7. 5。3. 2 十 二 烷 基 硫 酸 钠 的 增 溶 作 用表 面 活 性 剂 在 水 溶

12、 液 中 形 成 胶 束 后 ,使 不 溶 或 微 溶 于 水 的 有 机 化 合 物 的 溶 解 度 增 大 。 同 时 ,有 机 化 合物 同 时 也 会 改 变 胶 束 的 形 状 、 大 小 以 及 胶 束 内 环 境 的 性 质 ,且 增 溶 后 能 使 胶 束 表 面 和 内 部 化 学 位 降 低 。 使图 1 SDS的 浓 度 对 亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌色 谱 峰 面 积 的 影 响Fig. 1 The effect of the concentration ofsodium dodecyl sulfate ( SDS ) on thepeak area of mena

13、dione sodium bifulfite背 景 电 解 质 ( the background electrolyte) : 40mmol/L磷 酸 缓 冲 溶 液 ( phosphate buffer )(pH = 7. 5) ;工 作 电 压 ( app lied voltage) : 15kV;电 流 ( current) : 45 mA;进 样 ( injection) :6. 5 cm 8 s。用 表 面 活 性 剂 增 溶 难 溶 物 质 时 ,应 该 首 先 考 虑 使 用 便 宜 易 得 ,浓 度低 的 表 面 活 性 剂 ,使 用 最 多 的 有 十 二 烷 基 硫 酸 钠

14、 ( SDS,临 界 胶 束 浓度 为 9. 7 mmol/L) 10 。 表 面 活 性 剂 增 溶 作 用 与 其 所 形 成 的 胶 束 密切 相 关 ,在 临 界 胶 束 浓 度 之 前 ,没 有 增 溶 作 用 ;在 临 界 胶 束 浓 度 之后 ,增 溶 作 用 才 明 显 。 在 溶 液 中 ,被 增 溶 物 在 胶 束 中 的 状 态 和 位 置取 决 于 亲 水 基 和 疏 水 基 的 相 对 平 衡 。 表 面 活 性 剂 分 子 的 亲 水 基 向外 ,疏 水 基 向 内 ,被 增 溶 物 质 进 入 胶 团 中 心 而 使 其 溶 解 度 增 大 。SDS对 亚 硫 酸

15、 氢 钠 甲 萘 醌 的 增 溶 作 用 发 生 在 SDS胶 束 的 “ 栅 栏 ” 之间 ,即 非 极 性 的 苯 环 插 入 胶 束 内 部 ,极 性 头 处 于 SDS的 极 性 基 SO -3之 间 ,通 过 氢 键 或 者 偶 极 子 相 互 作 用 联 系 起 来 。实 验 发 现 ,在 40 mmol/L磷 酸 盐 介 质 中 ,随 着 SDS浓 度 的 增加 ,亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 的 色 谱 峰 对 称 且 基 线 平 稳 ,在 SDS钠 浓 度为 10 50 mmol/L时 ,亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 色 谱 峰 面 积 随 着 SDS浓度 的 增 加 不

16、 断 增 加 。 但 是 ,当 SDS浓 度 小 于 10 mmol/L时 ,亚 硫酸 氢 钠 甲 萘 醌 色 谱 峰 面 积 并 不 随 浓 度 增 加 而 有 明 显 的 改 变 ;而 当SDS浓 度 大 于 50 mmol/L时 ,亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 色 谱 峰 面 积 的 增加 亦 不 再 明 显 (图 1)。 因 此 ,选 择 SDS的 浓 度 为 50 mmol/L。3. 3 线 性 范 围 、 检 出 限 和 精 密 度在 选 定 的 实 验 条 件 下 ,以 磷 酸 吡 哆 醛 为 内 标 物 对 亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 进 行 测 定 。 亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌标 准 样 品 的 电 泳 谱 图 见 图 2a。 亚 硫 酸 氢 钠 甲 萘 醌 的 色 谱 峰 面 积 ( y)与 其 浓 度 ( x)呈 线 性 关 系 ,线 性 范 围为 6. 61 318. 73mg /L;回 归 曲 线 为 y =