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1、20基于BOX-PCR和REP-PCR技术的青枯雷尔氏菌多态性分析 基金项目：国家自然基金（No.30871667），福建省自然基金项目（No.2008J0054），福建省自然基金项目（No.2009J01087）和福建省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金（No.STIF-Y03）作者简介：林海云（1988-），硕士研究生，Tel：18705044875；E-mail：。通讯作者：刘波（1957-），博士，研究员，研究方向为微生物生物技术与农业生物药物，Tel：13905917339；E-mail：。林海云1,2，车建美1，刘波1*，郑雪芳1，肖荣凤1（1、福建省农业科学院农业生物
2、资源研究所， 福州 350003；2、福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福州350002）摘 要：研究青枯雷尔氏菌的遗传多样性对于了解青枯病的发生和流行具有十分重要的意义。本文利用青枯雷尔氏菌特异性引物鉴定84株来自福建地区不同寄主的青枯雷尔氏菌，结果表明，这些菌株均在504 bp位置出现特异性条带；采用BOX-PCR和REP-PCR对这些菌株进行多态性分析表明BOX-PCR扩增出19条特异性条带，REP-PCR扩增出20条特异性条带。系统聚类结果表明，青枯雷尔氏菌的遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性，其中，寄主植物是在遗传差异中起主导作用。进一步分析可知，地域性的差异主
3、要由BOX-PCR提供，寄主间的差异主要由REP-PCR提供。BOX-PCR和REP-PCR多态性分析技术为我国青枯雷尔氏菌多态性研究提供了另一条途径。关键词：青枯雷尔氏菌；多态性；BOX-PCR；REP-PCR；菌株鉴定Genetic diversity analysis of Ralstonia solanacearum based on BOX-PCR and REP-PCRLin HaiYun1,2, Che JianMei1, Liu Bo1*, Zheng XueFang1, Xiao RongFeng1（1.Agricultural Bio-Resources Research
4、Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences , Fuzhou, 350003, China; 2. Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of Education, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, 350002, China）Abstract：The genetic diversity of Ralstonia solanacearum was very important for
5、 knowing the polymorphism of bacterial wilt diseases. The special primer was used to identify Ralstonia solanacearum strains, in which 84 strains of R. solanacearum from different host plants in the Fujian province were identified with a specific band in the location of 504 bp. By BOX-PCR and REP-PC
6、R polymorphism analysis, the BOX-PCR amplified 19 specific bands and the REP-PCR amplified 20 specific bands. The cluster analysis showed that the genetic diversity of R. solanacearum was concerned with geographic origin and host plants, respectively. The different host plants played a leading role
7、in the genetic difference of R. solanacearum, while the difference of regions was mainly provided by the BOX-PCR, and the difference of host plants was mainly provided by REP-PCR. It was indicated that REP-PCR and BOX-PCR could provide an alternative way for the study of genetic diversity of R. sola
8、nacearum. Key words：Ralstonia solanacearum；Genetic diversity；BOX-PCR；REP-PCR；Identification细菌性青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的一种重要土传植物病害，广泛分布在热带和亚热带地区，侵染寄主范围很广，包括单子叶和双子叶植物（Remenant, 2010）。据报道青枯病原菌可侵染50多个科数百种植物，包括花生、番茄、茄子和辣椒等经济作物，并且近年来青枯病在中国继续加重，新的寄主也在不断地被发现（石元春, 2002），其中茄科植物受青枯病危害最重，涉及的作物种类最多（杨玉红, 2008）。青枯病原菌是一个复杂的群体
9、，生理分化很明显。不同地区和不同寄主来源的菌株，在寄主范围、生化型、致病力和血清型等细菌学特性上差异很大，这导致其病害防治较为困难，使其成为世界上危害最大、分布最广和造成损失最为严重的植物病害之一（卫红萍, 2010）。研究青枯雷尔氏菌的遗传多样性对于了解青枯病的发生和进行病害的生物防治具有重要的意义，而采用分子手段对病原菌多态性研究更为准确，并且更为快速（Versalovic and Lupski, 2002）。重复片段PCR基因指纹分析（Repetitive-element PCR genomic fingerprinting，rep-PCR）是利用细菌基因组中广泛分布的短重复序列为引物的
10、靶序列PCR扩增，通过对PCR产物电泳结果的比较，进而分析菌株间基因组存在的差异，其中BOX-PCR、REP-PCR和ERIC-PCR是细菌基因组中主要的3种PCR短重复序列（刘佳研等, 2006; 姬广海等, 2002; 杨凤环等, 2008）。Bruijn等（1996）研究发现，rep-PCR基因指纹分析具有可重复性并且通过简单的方法就能将相似的菌株鉴别出来，现已被广泛用于细菌和真菌中多样性分析（Genersch and Otten, 2003; Meintains et al., 2008; 姬广海等, 2002; 戴世鲲等, 2005; 李洁和熊智, 2006; 项明洁, 2010）。
11、 目前，该技术在青枯雷尔氏菌多态性的分析多见于国外报道，Horita和Tsuchiya（2001）发现利用rep-PCR技术可将78株来自日本以及其他各国青枯雷尔氏菌菌株按不同生化型区分出来。Norman等（2009）利用rep-PCR将不同来源青枯雷尔氏菌、不同寄主以及不同生化型青枯雷尔氏菌区分出来，并且该技术可以很容易将生化变种3型与生化变种1型和2型区分出来。并且利用BOX-PCR不仅可将不同地理分布青枯雷尔氏菌区分开来（Khakvar et al., 2008），而且还能区分出不同致病型的青枯雷尔氏菌（Khakvar, 2009）。在我国从分子水平上对青枯雷尔氏菌多态性分析主要采用RA
12、PD技术，但是RAPD技术重复性差，多态性谱型少，不能提供稳定且丰富的信息量的缺点（姜自锋等, 2002），目前在我国利用rep-PCR技术对青枯雷尔氏菌多态性研究的报道不多，主要有徐世典（http:/ir.lib.nchu.edu.tw/ handle/309270000/28829）发现BOX-PCR和REP-PCR技术可将台湾地区马铃薯青枯病菌株按生化变种分为两个类群。尹燕妮（2007）通过BOX-PCR技术分析发现中国青枯病菌的基因型与寄主存在一定的关系，并且可以将生化型2/生理小种3和生化型5的菌株区分出来。福建省由于受气候的影响，植物性青枯病病害发生十分频繁。在福建省中青枯病是花生
13、、烟草和番茄等许多重要经济作物主要病害之一，一旦爆发常常造成毁灭性的破坏（陈瑞泰等, 1997; 陈晓敏等, 2000; 霍沁建等, 2007），这给农业造成巨大的经济损失。研究青枯雷尔氏菌的遗传多样性对于了解青枯病的发生和流行具有十分重要的意义，但目前关于福建省青枯雷尔氏菌多态性分析方面的报道较少（王秋红等, 2007; 郑雪芳, 2008）。本研究利用BOX-PCR和REP-PCR技术对来源于福建省不同地区，主要受青枯病病原菌危害的5种寄主植物的84株青枯雷尔氏菌展开多态性分析，希望从寄主以及地理来源两方面揭示青枯雷尔氏菌遗传多样性，以期为了解福建省青枯病的发生和青枯雷尔氏菌的致病机理提供
14、参考。1 结果与分析1.1 青枯雷尔氏菌的分子鉴定10005003000bp青枯雷尔氏菌分子鉴定结果见图1。通过特异性引物鉴定青枯雷尔氏菌，预期片段大小为504 bp，青枯雷尔氏菌均可扩增出该片段，非青枯雷尔氏菌FJAT-68未能在504 bp位置扩增出条带，通过该引物鉴定出84株青枯雷尔氏菌菌株，均在504 bp位置扩增出单一条带。图1 不同寄主青枯雷尔氏菌的分子鉴定Fig.1 Molecular identification of Ralstonia solanacearum from different host plants1.2 青枯雷尔氏菌的BOX-PCR多态性分析不同寄主青枯雷尔
15、氏菌BOX-PCR结果见图2、3、4、5和表1。采用BOX引物扩增的多态性条带均在100-3000 bp之间，共扩增出20条条带，其中300-400 bp之间的1条带为所有菌株共有的条带，其余为特异性条带，多态性带比率达到95.00%，说明BOX引物在不同寄主青枯雷尔氏菌菌株间扩增的条带具有一定的差异，可以用于青枯雷尔氏菌菌株的多态性分析。3000bp1000500图2 不同寄主青枯雷尔氏菌BOX-PCR扩增结果电泳图谱（1）3000bp1000500Fig.2 BOX-PCR amplified of Ralstonia solanacearum from different host plants（1）图3 不同寄主青枯雷尔氏菌BOX-PCR扩增结果电泳图（2）3000bp1000500Fig.3 BOX-PCR amplified of Ralstonia solanacearum from different host plants（2）图4 不同寄主青枯雷尔氏菌BOX-PCR扩增结果电泳图（3）3000bp1000500Fig.4 BOX-PCR amplified of Ralstonia solanacearum from different host plants（3）图5 不同寄主青枯雷尔氏菌BOX-PCR扩增结果电泳图（4
