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1、细胞因子的检测方法,左大明 ,细胞因子,一类由细胞分泌，具有多种功能的高活性小分子蛋白，参与免疫调节和多种生理病理过程等。 白细胞介素(interleukin, IL) 干扰素(interferon, IFN) 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF) 集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF) 生长因子(growth factor, GF) 趋化因子(chemokine),细胞因子的检测方法,待检样品(细胞上清) 指示细胞（CTLL-2） IL-2依赖细胞系,按不同稀释度加入,37C，16-20小时,加入3HTdR（1-5Ci）,
2、37C，4-6小时,收集细胞,测定,细胞增殖实验,细胞病变抑制实验,待检样品（细胞上清） IFN-指示细胞（wish）,按不同稀释度加入,37C，4小时,37C，24-48小时,弃取上清，加入VSV(水泡性口炎病毒),观察细胞病变（镜检或比色）,Using CFSE to track CML progenitor proliferation,SDM,SDM + Glivec,Calculation of Proliferative Index (P.I.),CFSE -,4 3 2 1 0,The Proliferative Index is the sum of the cells in a
3、ll generations divided by the calculated number of original parent cells. It is useful for comparing quantity of cell division between cultures of the same cells undergoing different treatments.,Cell Proliferation ELISA Kit, BrdU (colorimetric),Chromium-51 (51Cr) release assays,计数受趋化细胞,趋化因子,细胞,趋化实验示
4、意图,微孔滤膜,用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。,免疫标记技术,高通量细胞因子检测 CBA (Cytometric Bead Array)是一种微珠多用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而且可以得到一个样本的多个数据。,LOGO,Cytokine network,LOGO,LOGO,C
5、BA原理示意图,LOGO,LOGO,Lab Invest 2003, 83:11311146,cytokine bead arrays(CBA),ELISPOT(酶联免疫斑点实验),ELISPOT技术利用结合在固相载体上的抗细胞因子的特异性抗体，在分泌细胞周围直接扑获待检细胞因子。实验中每个斑点（spot）是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。它可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力。 优点：灵敏度高，是目前为止最灵敏的检测技术。可检测到百万分之一阳性细胞率; 单细胞水平、活细胞功能检测; 操作简便，可进行高通量筛选。,1.特异性单抗包被在培养板孔底部； 2.封闭
6、能结合单抗的其他部位；,3.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞分泌的细胞因子被单抗捕获；,4.移出细胞，洗涤；,5.加入生物素标记的二抗；,6.加入酶标链霉亲和素；,7.加入显色底物，在酶的催化分解下，产生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；,8.斑点计数（可人工计数，也可用自动读板仪计数），数据处理，结果分析。,ELISPOT,应 用,移植研究-allograft rejection 疫苗开发-亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响 Th0/Th1/Th2细胞转换分析 自体免疫研究-免疫调节及免疫治疗研究 癌症研究-肿瘤反应T细胞作用 过敏机制探讨-IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参
7、与过敏机制之细胞因子的研究 传染疾病研究-Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, 等,Medium,PHA,Peptide 1,Peptide 21,Peptide 47,GzB,HIV- peptide recall patient B,IFN- g,HIV-peptide specific recall response shows dissociated production of IFN- g and GzB,Kleen
8、 T. et al, AIDS 2003, 18: 383-392,LOGO,ELISPOT 和 ELISA的区别,ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破传统 ELISA 法，是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展，它们最大的不同:,1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量(整体水平);ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率（单细胞水平）；2.ELISPOT比ELISA更
9、敏感。,ELISPOT技术应用领域：自身免疫诊断和预后分析、器官移植后排斥反应的预测、过敏性疾病脱敏治疗的监测、疫苗和药品的研发与检测等。,LOGO,胞内细胞因子的检测,LPS活化单核细胞内TNF-的测定R1：淋巴细胞；R2：单核细胞,TNF-的诱生和检测,主要由单核/巨噬细胞及其他多种细胞产生，能使杀伤肿瘤细胞; THP-1(人单核细胞系)在LPS(脂多糖)刺激下可分泌TNF-; L929(小鼠成纤维细胞)可被THP-1分泌的TNF-杀伤，且细胞的死亡率与TNF-活性成正比; 四甲基偶氮唑盐(MTT)在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶的作用下，被还原呈蓝黑色的MTT-甲瓒。,离心收集培养上清,加入,加入四甲基偶氮唑盐(MTT),37C, 5%CO2, LPS, 18-24h,放线菌素D处理,37C, 5%CO2, 18-24h,37C, 5%CO2, 4-6h,吸出上清，加入DMSO，测OD570,TNF-的诱生和检测,
