生化检测方法汇总-（最新版-已修订）

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1、一、血清谷丙转氨酶（SGPT）赖氏改良法 器材:试管及试管架、移液器或吸量管、恒温水浴锅、721型分光光度计、温度计、动物血清 试剂: （1）0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液： 0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取 Na2HPO414.22g 或 Na2HPO42H2O17.8g 溶 解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml,4保存。 0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液：称 KH2PO413.61g 溶解 dH2O 中，稀释至1000ml, 4保存。 将0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液420ml 和0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液80ml 混和即 为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲

2、液。加氯仿数滴，4保存。 （2）标准丙酮酸（含丙酮酸2.0mol/mL） ： 取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为50mL。此液须当日用当日配。 （3）SGPT底物液(含-酮戊二酸2mol/ml 及 DL-丙氨酸200mol/ml) : 取-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸7g ,用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol /L NaOH 调 pH 7.4（因为转氨酶在 pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下降） ，加数滴 氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。 （4） GOT 底物液(DL天冬氨酸200mmol/L ,-酮戊二酸 2mmol/L):称取- 酮戊二酸29.

3、2mg 和 DL-门冬氨酸2.66g 置于一小烧杯中,加入1mol/L 氢氧化钠20.5ml 使溶解,并校正 pH 至7.4,然后将溶液移入100ml 容量瓶内,用0.1mol/L 磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰 箱内保存。 （5）2.4-二硝基苯肼溶液: 取分析纯2,4-二硝基苯肼19.8mg，用1mol/L HCl 溶于100ml，置棕色瓶中保存。 （6）0.4mol/L NaOH 溶液: 称取16g 固体 NaOH，用蒸馏水溶解，冷却至室温，定容至1000mL，备用。 操作步骤： 1、标准曲线绘制：取试管 18 支按下表操作。 试 管 号对 照12345 丙酮酸标准液（1 毫升 2 微克

4、分子）00.050.100.150.200.25 SGPT 或 SGOT 底物0.500.450.400.350.300.25 0.1M 磷酸盐缓冲液 PH7.40.10.10.10.10.10.1 相当于谷丙转氨酶单位0285797150200 相当于谷草转氨酶单位02461114190 每个样做 3 个平行， 置 37 水浴 30 分钟， 各管加 2， 4-二硝基苯肼液 0.5mL， 混匀， 再在 37 水浴中放置 20mL， 各管加 0.4mol/L 氢氧化钠溶液 5mL， 混匀， 10 分钟后， 从水浴箱中取出， 以蒸馏水调“零”点，用 520nm 波长比色，读取各管之吸光值，各管之吸

5、光值均减去空白的 吸光值，然后以吸光值为纵坐标，各管相应的转氨酶单位为横坐标。绘制成标准曲线。为了 方便，可列出各光度相当于转氨酶单位表。 2、酶活性测定：取试管两支，注明测定管及对照管。 试剂样品测定（每个样 3 个平行）对 照（每个样 3 个平行） 血 清（mL）0.10.1 SGPT 或 SGOT 底物（mL）0.5 置 37水浴 30 分钟（SGOT 为 37，60 分钟后再加枸橼酸苯胺 1 滴） 2.4-二硝基苯肼（mL）0.50.5 置 37水浴 20 分钟 SGPT 或 SGOT 底物（mL）0.5 NaOH 溶液（mL）5.05.0 对照及样品各做 3 个平行，充分摇匀，静置

6、10 分钟后，用 520nm 波长比色，以蒸馏水调 节零点，读取吸光值，用样品减去对照吸光值，求得样品的谷丙转氨酶活力。 谷丙转氨酶活性单位： 37， pH7.4，每小时每毫升血清催化生成 1mol 丙酮酸为 1 个单位。例 ： 0.1ml 血清每小时催化生成 0.1mol 丙酮酸, 即相当于 GPT 100U / 100ml 血清。 注意： 1. 在测定 SGPT 时，应事先将底物、血清在 37水浴中 保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。 2. 标准曲线上数值在 20500U 是准确可靠的，超过 500U 时，需将样品稀释。 3. 转氨酶只能作用于L氨基酸，对 D氨基酸无 作用。实验室多

7、用DL氨基酸（较 L氨基酸 价廉） ，若用 L氨基酸，则用量减半。 4. 溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高， 会影响测定效果。 5. 血清样品的测定需在显色后 30 分钟内完成。 6.丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封后易 变质为多聚丙酮酸，而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不 易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液。 7.每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过 0.015A，若有 超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。 8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本 可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管 优点：尽管基质液中余下的 a-酮戊二酸同样可

8、生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果,但 因其量不多,加之对 505nm 的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强,尤其用标准曲线 作测定时,所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正,摈弃了赖氏法一些固有弊端,结 果比其他比色法准确.故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏 法.1981 年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定 ALT 活性较为合理, 缺点：由 于赖氏法设计的底物浓度,如 a-酮戊二酸不足,反应速度只能达到最大速度的 65%;显色剂 2,4- 二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半;保温 30min 的酶促反应后,新生成的丙酮酸 和未用完的

9、 a-酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题,如此等等,使赖氏法的重 现性较差,在测量精度上仍与连续监测法相差甚大. * 1 个卡门氏单位的定义是：在温度 25，pH7.4，波长 340nm，光径 1cm 的条件下，1ml 血清使 NADH 的吸光度下降 0.001 的转氨酶活性。 * 国际单位：在最适温度（25）下，1 分钟产生 1mol 丙酮酸的酶量为 1 个活性单位，即 1IU=1umol/min。 * King 法单位定义是：每 1ml 血清在 37条件下与底物作用 60 min，生 成 1mol 丙酮酸称为一个单位。 * Mohun 法单位定义是：每毫升血清在 pH=7.4，

10、37条件下与底物作用 30 min，每生成 2.5 微克丙酮酸为 1 单位。 二、尿素氮（BUN） （二乙酰一肟法尿素测定二乙酰一肟法尿素测定） （一）仪器设备：水浴锅、紫外分光光度计、10mL 试管 （二）试剂： 1、尿素氮试剂 ： 蒸馏水 100mL， 浓硫酸 44mL， 85%磷酸 66mL， 冷却至室温后， 加氨基硫脲 50mg， 硫酸镉（3CdSO48H2O）2g，溶解后稀释至 1000mL。 2、20g/L 二乙酰一肟试剂：称取二乙酰一肟 20g，加入蒸馏水溶解，定容至 1000mL。 3、尿素氮标准贮存液（357mmol/L）：称取尿素 1.072g 溶解于蒸馏水中定容至 100

11、0mL，至于棕色瓶中贮存。 4、尿素氮标准应用液 （17.85mmol/L） ： 取贮存液 5mL， 加蒸馏水定容至 100mL。 （三）操作步骤 按下面表格的试剂配比操作： 试剂测定管标准管空白管 血清（ml）0.02- 尿素氮标应用准液 （ml）-0.02- 蒸馏水（ml）0.02 二乙酰-肟试剂（ml）0.50.50.5 尿素氮试剂（ml）5.05.05.0 按上述表的配方每个样做 3 个平行样，混匀，置沸水浴中加热 15min，立即 用自来水冷却 5 分钟。分光光度计选用 540nm 波长，以空白管调零点，读取各 管吸光度。 尿素（mg%）=测定管吸光度/标准管吸光度17.85(mg/

12、ml) 1. 此法灵敏度高，用量极微（一般只需 0.02ml 血清即可） 。本实验是先将血清用生理 水以 1：4 加以稀释再取 0.1ml，故最后计算时，应乘以稀释倍数“5” 2. 试剂中加入硫胺脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度褪色现象 （小于 5%/h） 。 3. 此法操作简单，特异性强，不受其他非蛋白质含氮化合物如尿酸、肌酸等影响，但 应控制好实验条件。 4. 吸管必须校正，使用时务必注意清洁干净，加量务必准确。 5.尿液中的尿素氮也可用此法进行测定。由于尿液中尿素氮含量高，标本需用蒸馏水 以 1:50 稀释。如果呈色后吸光度仍超过本法的线性范围，还需将尿液再稀释，重新测

13、 定。 3尿素浓度以前习惯用尿素氮表示，尿素分子中含有二个氮原子，因此 1mmol/L 尿3尿素浓度以前习惯用尿素氮表示，尿素分子中含有二个氮原子，因此 1mmol/L 尿 素等于 2 mmol/L 尿素氮。世界卫生组织推荐使用尿素，并以 mmol/L 表示浓度单位，素等于 2 mmol/L 尿素氮。世界卫生组织推荐使用尿素，并以 mmol/L 表示浓度单位， 我国卫生部也已规定一律使用尿素，不再使用尿素氮一词。 我国卫生部也已规定一律使用尿素，不再使用尿素氮一词。 尿素氮 mg% = 测定管/标准管0.002100/0.15尿素氮 mg% = 测定管/标准管0.002100/0.15 = 测

14、定管/标准管10 = 测定管/标准管10 【参考范围】 【参考范围】 5-20 mg/dl 5-20 mg/dl 三、肌酐（Cr） 四、血糖（Glu） （邻甲苯胺法） 血糖是指血液中的葡萄糖，葡萄糖与冰醋酸、邻甲苯胺共热时，葡萄糖先 脱水转化为羟甲基糠醛，再与邻甲苯胺缩合为蓝绿色的薛夫碱，其颜色的深浅 与葡萄糖含量成正比。可用比色法进行定量测定。 1、仪器：紫外分光光度计、水浴锅 2、试剂： （1） 葡萄糖标准母液 （10mg/ml，用饱和苯甲酸溶液配制） （2）邻甲苯胺溶液： 2.5g 硫脲溶于冰醋酸，加入邻甲苯胺 150ml 及 2.4%硼酸 100ml，用冰醋酸 定容至 1 升。 3、操

15、作步骤： （1）配置不同浓度葡萄糖标准溶液：取 5 支 10ml 容量瓶，标号，依次加入葡 萄糖母液 0.25， 0.5， 1.0， 2.0， 3.0ml， 用饱和苯甲酸稀释至 10ml， 混匀 （则 上述溶液 100ml 葡萄糖含量为 25，50，100，200，300mg ） ； （2）分别精密吸取不同浓度葡萄糖标准溶液于试管中，设平行管，空白管加 0.1mL 蒸馏水，各管加入邻甲苯胺试剂 5.0mL，混匀后，置沸水中 15 分 钟，立即移入冷水浴中冷却； （3）以空白号管调零，于紫外分光光度计波长 630nm 处测吸光值，以各管的 吸光度为纵坐标，相应管中葡萄糖含量（mg）为横坐标，绘制

16、标准曲线， 得出线性方程。 （4）测试样品：取全血 0.1mL，设平行样，按上述方法测出其A630nm吸光值， 通过线性方程求出其血糖含量。 试剂（mL）012345 邻甲苯胺试剂5.05.05.05.05.05.0 不同浓度葡萄糖标准溶 液 00.10.10.10.10.1 蒸馏水0.100000 100mL 全血相当于葡萄 糖质量 mg 02550100200300 A630nm0.000 注意事项： 1. 本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与醛糖显色，血液中其他还原性物 质基本上无影响。 2. 邻甲苯胺试剂与葡萄糖显色的深浅及其稳定性与试剂中邻甲苯胺浓度、 冰醋 酸浓度、加热时间有关。此法显色稳定，24 小时内无变化。如将加热时间缩短， 生成颜色容易消褪。 3. 轻度溶血的血清对结果无明显影响。根据推导，血清中含血红蛋白 450 毫 克/100 毫升时，可使测定结果降低约 1