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1、细胞培养的甚本概念,传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。,细胞培养：使用细胞悬液 组织培养：使用组织块（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米） 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫,培养细胞的特性,培养细胞的生长方式 贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞 兼性贴壁生长,贴附型细胞,动物细胞体外培养特点,培养要严格在无菌条件下进行，细菌、真菌、病 毒、或其它细胞均可导
2、致培养物的污染。,培养细胞生长的条件,1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒,实验室,实验准备,实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管,压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用于玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用
3、滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,滤 器,CO2培养,CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ，14 h)。 箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,酶标仪 微孔
4、板震荡器,培 养 板,培养瓶,常用玻璃器皿清洗 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干,清洁液的配制,2 细胞培养用液的配制 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml,消化液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2
5、+的PBS缓冲液配制，常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,培养基,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然 培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸 液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染,合成培养基,合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方 法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、 MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
6、合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐 和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持 细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清 对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清 中的复杂成分至今尚未完全清
7、楚 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制 因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映 的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切 需要用无血清培养基培养细胞,无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充 各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁 和扩展因子 等。 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组 成。 1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细 胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培 养基中成功地生长和增殖。 无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、 可重复
8、性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯 和鉴定各种细胞产物的程序。,向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特 的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一 种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清,血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血 清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、 支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌,抗菌素的使用： 在培养液
9、配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存 在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素 最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定,完全培养基的组成,基础培养基 80一95 血清 5一20 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100卑位毫升,培养基的配制,RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加双蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10）,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）,游离期： 细胞接种后在培
10、养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质 回缩，胞体呈圆球形。 10分钟一4小时,贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小 时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白 （生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于 底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）,潜伏期 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6 24小时。,对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活
11、力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性,培养细胞活力测定,细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态 上区别死、活细胞是困难的。 1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形 成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率比克隆形成数接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠,台盼蓝法,活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中 的百分比表示细胞恬力 已淘汰,四唑盐（MTT）比色法,四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝， 四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不 溶于
12、水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细 胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中 蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 再用酶标仪测定OD值 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试 验、肿瘤放射敏感性实验等。,操作步骤 （1）单细胞悬液接种于96孔培养 板；103-104细胞/孔，每孔培养基总 量200微升（96孔培养板每孔容积 370微升），37、5CO2培养箱 中培养一段时间（根据实验目的决 定培养时间） （2）加入2毫克毫升的MTT液 （50微升孔）；继续培养3小时。 （3）吸出孔内培养液后，加入 DMSO液（15
13、0微升孔），将培养 板置于微孔板扳荡器上振荡10分 钟，使结晶物溶解。 （4）酶标仪检测各孔OD值（检测 波长为570 nm）。记录结果，绘制 细胞生长曲线,细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细 胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、 经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细、 胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰 晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤 和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶， 即冰晶的重结晶
14、。,慢冻程序,标准程序： 当温度在-25 以上时， 12 /min 当温度达-25 以下时， 510 /min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中细胞冻存器 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳， 通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降 12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直 接投人液氮中。,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护 剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低 冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出 细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，
15、从而减少 冰晶对细胞的损伤。,细胞冻存方法,1预先配制冻存液： 含20%血清培养基，10% DMSO 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml) 3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称 和冷冻日期。 4 年后，存洁率可达80一叽。DMSO液用培养液配 好，避免因临时配制产热而伤害细胞。,细胞复苏方法,（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴 中，使其融化（1分钟左右）。 （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,细胞培养方法,
16、悬滴培养法 旋转管培养法 灌注小室培养法 培养瓶培养法 培养板培养法,原代培养与传代培养技术,原代培养与传代培养技术,组织块培养,组织消化培养,取材分离 组织消化（胰蛋白酶、胶原酶） 培养过程,传代培养,组织工程,定义：组织工程一词最早是在1987年美国科学基金会 在华盛顿举办的生物工程小组会上提出，1988年正式 定义为：应用生命科学与工程学的原理与技术，在正 确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构 与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、 促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物 替代物的一门新兴学科,组织工程研究主要包括四个方面：种子细胞、生物材料、构建 组织和器官的方法和技术以及组织工程的临床应用。 目前临床上常用的组织修复途径大致有3种：即自体组织移植、 异体组织移植或应用人工代用品。这三种方法都分别存在不 足，如免疫排斥反应及供体不足等。 组织工程的发展将从根本上解决组织和器官缺损
