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1、1,第五章 微生物的生长繁殖与生存因子,第一节 微生物的生长繁殖 第二节 微生物的生存因子 第三节 其它不利环境因子对微生物的影响 第四节 微生物之间的关系 第五节 菌种的退化、复壮与保藏,1、微生物的生长：微生物在适宜的环境条件下，不断吸收营养物质，按照自己的代谢方式进行新陈代谢活动。如果同化作用大于异化作用，微生物的细胞质量不断迅速增长（生命个体的重量和体积不断增大），称为微生物的生长。 2、单细胞微生物的繁殖：当单细胞个体生长到一定程度时，由一个亲代细胞分裂为两个大小、形状与亲代细胞相似的子代细胞，使得个体数目增加，这是单细胞微生物的繁殖。,第一节 微生物的生长繁殖,一、微生物生长繁殖的
2、概念,2,3,3、微生物的发育微生物的生长与繁殖是交替进行的，从生长到繁殖，是微生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。 4、世代时间(代时)指微生物（如细菌）的两次细胞分裂之间的时间。包括细胞核物质和细胞质加倍增长，然后平均分配到两个新细胞中。 每一种微生物在一定的培养条件（如营养组成、pH、温度和通气等）下，其代时是一定的；当环境条件发生改变，其代时也会改变。 不同种的微生物生长繁殖速率不同，其代时也不同：原核微生物的代时真核微生物的代时；好氧菌的代时专性厌氧菌的代时,5. 多细胞微生物的生长繁殖 生长：细胞数目增加，个体数目不增加。 繁殖：细胞数目增加
3、，个体数目也增加。,4,二、研究微生物生长的方法,微生物的生长可分为个体微生物的生长、群体微生物的生长。通常通过培养研究微生物的群体生长（以微生物群体作为研究对象，来研究它们的生长）。培养方法大体上可以分为两种情况： 一种是分批式培养（间歇式培养），培养基一次性加入，不更换 ；另一种是连续式培养。 一般通过测定细菌重量或数量随培养时间延续的曲线关系来考察细菌的生长特性。,5,（一）分批培养和生长曲线,1、分批培养（间歇培养）概念：是将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定量液体培养基的容器内，在适宜的条件下培养（保持一定的温度、pH和DO），微生物在其中生长繁殖；结果出现微生物的数量由少变多
4、，达到高峰后又由多变少，甚至死亡的变化规律（微生物的生长曲线）。 2、生长曲线 用坐标法作图，以培养时间为横坐标，以计数获得的微生物数量的对数为纵坐标，可以绘出一条定量描述液体培养基中微生物生长规律的实验曲线，该曲线则称为生长曲线。（ growth curve )。,6,生长曲线的制作,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体 培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样， 测细菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目 的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,7,生长曲线,稳定期,衰老期,微生物的数量很大，都是10的n次方，取对数作图时方便。,总细胞数,活细胞数,为什么微生物数目用对数
5、值作图？,8,9,（1）停滞期（迟滞期、调整期、适应期）,当细菌被接种到新鲜培养基中，开始一段时间内，通常不立即进行细胞分裂、增殖，生长速率近于零，细胞数目几乎保持不变，甚至稍有减少，这段时间被称为停滞期。,特征 代谢活跃，体积增大，从介质中快速吸收各种营养物质，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP和其他细胞成分，为细胞分裂作准备。,原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物,现象：活菌数几乎没增加，曲线平行于横轴。,10,接种群体菌龄： 用对数生长期的菌种接种时，其停滞期较短，甚至检查不到停滞期 接种量：一般来说， 接种量增大可缩短甚至消除停滞期 培养基成分： 在营养成分丰富的天然
6、培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。 世代时间：世代时间短，即繁殖速度较快的菌种的停滞期一般较短,影响停滞期长短的因素,11,应用,在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期； 采取的缩短lag phase 的措施有： 增加接种量； （群体优势-适应性增强） 采用对数生长期的健壮菌种； 调整培养基的成分，在种子培养基中加入发酵培养基的某些成分。 选用繁殖快的菌种 在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,12,在实际工作中如接种菌种以启动新的水处理设施，投加新鲜污泥时，接种的细菌不习惯于新环境，会
7、出现或长或短的停滞期，停滞期的出现会增加操作时间，降低工作效率。 可以通过增加接种量、采用最适种龄、选用繁殖速率快的菌种以及尽量保持接种前后所处的培养介质和条件一致等方法来缩短或消除停滞期。,环境领域应用,13,（2）对数期（指数期）,一旦细菌细胞的生理修复或调整完成，停滞期即告结束，细胞开始进入快速分裂阶段。这一时期细胞数目的增加以2n级数进行，细菌的数目X的增长率只与细菌的初始数量有关。,现象：细胞数目以几何级数增加， 其对数与时间呈直线关系。,14,特点,对数期的细胞分裂速度最快、生长速率常数最大、繁殖一代的时间（世代时间）最短、代谢活动最旺盛、对环境变化敏感。 细胞内的核糖体等组分也像
8、细胞数目一样以同样的对数生长速率增加，细胞合成核糖体以及蛋白质越多，其生长速率也越快。 细胞化学组分、菌体大小形态、生理特征等比较一致 对不良环境因素的抵抗力强,15,由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种的最佳菌龄； 发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。,应用意义：,影响因素：菌种、营养成分、营养物浓度、培养温度、DO、抑制剂,16,（3）静止期,如果对数期的细胞分裂不受节制的连续进行，理论上一个代时为20min。重10-12g的细菌，经过48h的对数生长之后，其群体重量可达到地球重量的
9、4000倍。 在一个封闭的系统中，细菌的对数生长只能维持一个短暂的时期，最终生长将会降低，代时延长，细胞活力减退。此时新生的细胞数目与死亡的细胞数目相等，总菌数达到最大值，活菌数保持恒定。,又称：稳定期、恒定期或最高生长期,17,静止期细胞从生理上的年轻转化为衰老，表现为细菌的代谢活力钝化，细胞含有较少的核糖体，RNA和蛋白质合成缓慢，mRNA的水平低下，因此细胞的生长变得不平衡，细胞的形状有的也发生改变。因不能维持细胞壁的合成与修复，细胞的染色特点也发生变化，如G+转变为G-。,18,特点： 新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养基中的细胞数目达到最高值。
10、 细胞分裂速度下降，开始积累内含物，芽孢杆菌开始产芽孢。 对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。 原因： 对数期消耗了营养物质，使其浓度降低； 有害代谢废物的大量积累(酸、醇、毒素等)； 营养物的比例失调，如碳氮比不合适； 理化条件(pH、DO、氧化还原势等)有所改变。,19,（4）衰亡期,处于静止期的细菌继续培养，细胞的死亡率将逐渐增加，最终群体中活的细胞数目将以对数速率急剧下降，此阶段就被称为衰亡期。,衰亡期细胞的总数虽然镜检直接计数可能会保持不变，但间接计数检测到的细胞数目却在减少（?），同时伴随着细胞的裂解或自溶可释放出一些代谢产物，如氨基酸、转化酶、
11、外肽酶或抗生素等。,20,特点,细菌利用贮存物进行内源呼吸(自溶) 。细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长” 。细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形。衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。 产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡,21,衰亡期的长短与对数生长期一样在不同微生物中变化是很大的，主要与菌种的遗传特性有关。 通过补充营养和能源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡期的细胞死亡速率，延长细菌培养物的存活时间。,22,分批培养的应用：序批式间歇曝气器（SBR） 工艺特点
12、：废水分批进入反应池，经过5个阶段：进水，反应，沉淀，排水，闲置。 SBR过程是典型的非稳态过程，有机物和微生物浓度在时间上是理想的推流状态，在空间上完全混合。因此比连续流法反应速度快，处理效率高，可以抑制专性好氧菌的过度繁殖，利于生物脱氮除磷。由于泥龄短，丝状菌不可能成为优势菌种，不会出现污泥膨胀。无需回流装置。 运行时间约为412h，其中反应时间4060。,23,1. 概念：在细菌进入对数生长期时，以一定的速率不断地补充新鲜营养物质，同时以同样的速率排除培养物(含菌体及代谢产物)，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速率和代谢活性处于某种稳定状态。,(二) 连续培养(c
13、ontinous culture),24,连续培养与间歇培养不同，它的特点是一方面连续进料，另一方面又连续出料。它又分为两种：恒浊连续培养和恒化连续培养。,2. 连续培养方法的分类,25,（1）恒浊连续培养,一种使培养液中细菌的浓度恒定，以浊度为控制指标的培养方式。培养基提供足够量的营养元素，细菌保持最大速率生长。通过控制进料流速使装置内细菌浊度保持一定，保持理论上的对数生长期，可获得大量菌体或与菌体代谢相平衡的代谢产物。这种方式往往用于细菌的生理生化研究。,26,恒浊连续培养 是通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定，使细菌生长连续进行的一种培养方式。 应用：发酵工艺采用该法以
14、获得大量菌体和有经济价值的代谢产物。,27,（2）恒化连续培养,新鲜培养基以恒定的流速流入，与培养器内的培养基瞬间混合，培养器内的培养基继而也以相同的流速恒定流出，进水组分及反应器中营养物浓度基本不变，因而这种细菌培养称为恒化连续培养。 恒化连续培养以恒定流速进水，以相同流速流出代谢产物，以维持进水中的营养成分恒定，使细菌处于最高生长速率状态的培养方法。 应用：污水生物处理(除SBR法)。,28,3.连续培养运行参数稀释率D D流动速率/容积 过低：新鲜营养补充不及时，导致大量细菌饥饿而死亡； 过高：生长速率低于排出速率,29,三、细菌生长曲线在污（废）水生物处理中的应用,1. 活性污泥的生长
15、曲线, 迟缓期 对数生长期 减速生长期 内源呼吸期,30,2. 活性污泥生长曲线对废水生物处理的指导意义,污泥消化:指废水处理中所产生污泥的厌氧生物处理。即污泥中的有机物在无氧条件下，被细菌降解为以甲烷为主的污泥气和稳定的污泥（称消化污泥）。,31,常规活性污泥不利用对数生长期的微生物而利用静止期的微生物的原因： 处于对数期的微生物代谢活力强，能去除大量有机物，但对进水有机物浓度需求高，使出水不易达到排放标准； 处于对数期的微生物生长繁殖旺盛，沉淀性能差，致使出水水质差； 处于静止期的微生物活力相对较差，但仍有相当的活力，去除有机物的效果仍较好； 处于静止期的微生物体内积累了大量贮存物，强化了
16、微生物的生物吸附能力，自我絮凝、凝合能力强，在二沉池中泥水分离效果好，出水水质好。,32,（一）微生物细胞数目的测定 1.测定微生物的总数(直接测定；直接计数法) 直接测定是常用的微生物生长测定方法，它借助显微镜直接观察计数，其优点是测定过程快速，缺点是不能区分微生物的死活。 计数器直接计数（计数器测定法） 染色涂片计数（涂片染色法） 比例计数法 比浊计数法 2. 测定活菌数(间接计数法),四、微生物生长量的测定方法,包括：1、微生物细胞数目的测定 2、微生物生物量的测定,33,1. 测定微生物的总数(直接计数法)- 计数器(血球计数板）测定法,适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物 测定细胞个体形态较小的则采用细菌计数板。,34,计数器测定法,将菌液滴在血球计数板0.1ml 的计数格中，细菌被固定染色后，在显微镜下选择数出若干个小格中的细菌数目，（一般数125个小格），根据比例关系折算出单
