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1、人教版选修3,专题1 基因工程 课题2 基因工程的基本操作程序,基因工程,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。（既是概念，又是原理）,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞
2、中稳定遗传和正确表达。,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,请阅读P9第一和二两段,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,1.基因文库：概念见P9,2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库,3.获取目的基因的根据：,见课本P9,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,4.基因文库的构建方法,基因组文库,某种生物某个
3、时期的mRNA,cDNA,受体菌群体,部分基因文库 （cDNA文库）,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,基因文库的构建方法之一,基因组文库的合成流程图解,某种生物的单链mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,cDNA文库的合成流程图解,基因文库的构建方法之二,5.基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,物种间的基因交流是什么？为什么基因组文库中只有部分基因可以进行物种间基因交流？,基因交流就是基因重新的组合，同一物种，不同物
4、种都可以（后代一般是不可育，因为已经后代已经和双亲的物种发生隔离（生殖隔离）判断物种间的基因交流主要依据为：一个物种的基因在另一个物种体内能否正常表达（即转录翻译出相应的蛋白质）。cDNA文库是根据mRNA序列进行逆转录而建立的，其中保存的基因在任何物种体内都能连续编码相应的氨基酸，从而合成出正常的蛋白质。（绝大多数生物共用一套遗传密码）。所以不同物种之间可以通过cDNA文库进行基因交流。但是基因组文库是直接从一种生物体内提取DNA而建立的。而原核生物与真核生物的基因结构是不同的。原核生物的基因是连续的，全部都可以编码蛋白质。但真核生物的基因是不连续的，分为外显子和内含子。只有外显子才能编码蛋
5、白质，而内含子是与外显子交错分布的。所以真核生物的基因中，编码蛋白质的区域是不连续的。所以原核生物的基因在原核生物或真核生物之间都可以正常表达，从而可以进行物种间的基因交流。但是真核生物的基因只有在真核生物体内才能通过真核生物特有的机制正常表达，在原核生物体内不能正常表达。所以基因组文库只能进行部分物种间的基因交流。即原核-原核，真核-真核，原核-真核生物间可以交流，但真核-原核间不能交流。, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术, 条件：_、 _ 、 _ 、 _, 原理：_, 方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）, 结果：,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段
6、,DNA复制,已知基因的核苷酸序列（前提）,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶（Taq酶）,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,(二)利用PCR技术扩增目的基因, 过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物处延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d、多次重复,(二)利用PCR技术扩增目的基因,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,
7、DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,目的基因的mRNA,单链DNA (cDNA）,双链DNA (即目的基因),反转录,合成,1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,（三）人工合成的目的基因,1.2 基因工程的基本操作程序,第二课时,5,3,3,5,5,3,5,3,5,
8、3,5,3,提取特定目的基因,引物A,引物B,P9寻根问底：为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基
9、因文库。,二、基因表达载体的构建基因工程的核心,构建目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,2、表达载体的组成 1）启动子 2）终止子 3）目的基因 4）标记基因等,它们各自的作用是什么?,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录,标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。,质粒,DNA分子,限制酶处理,1个切口 两个黏性末端,2个切口 获得
10、目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,3、过程:,表达载体,加工修饰,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子、终止子对于目的基因表达必不可少,是基因中的脱氧核苷酸序列，而起始密码和终止密码是mRNA中的核糖核苷酸序列 目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,1.2 基因工程的基本操作程序,第三课时,三、将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（
11、二）方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,过程：,导入的受体细胞：,受精卵或体细胞,最常用：,体细胞,2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因不能导入单子叶植物的
12、原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物； 要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的诱导的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中,P15思考与探究：,（2）基因枪法 （3）花粉管通道法,2、将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射法 受体细胞：受精卵 程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵早期胚胎培养 输卵管或子宫 发育成新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞 原核生
13、物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 最常用原核生物：大肠杆菌 大肠杆菌转化方法：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,（一）、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 (关键步骤), 首先取出转基因生物的基因组DNA 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,归纳步骤,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，
14、如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分 子 杂 交,方法:,抗原抗体杂交,过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,归纳步骤,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测 (分子 水平),鉴定 （个体水平）,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因
15、是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,3. 利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,P15思考与探究：,4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。 （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。 （4）培养
