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1、,第九章,免疫检测技术,免疫检测是目前生物学检测方法中用途最广泛的一种方法。 具有高度精确、灵敏、特异的特点。 可用于免疫学的基础理论和应用研究，也可应用于生物学研究的各个领域。,1 、免疫疾病诊断 2 、动物植物生理活动研究（激素、维生素） 3 、物种及微生物鉴定 4 、动物、植物性状的免疫标记 5 、免疫增强药物和疫苗的研究 6 、发病机理研究 7 、分子生物学研究,免疫检测技术在生物科学领域中的应用：,第一节 抗原抗体反应原理,抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种 结合在体外也能发生，当抗原和抗体在体外特异性结合后 可出现肉眼可见或借助仪器可检测出的反应现象。 试验时既可用已知
2、抗体检测标本中有无相应抗原，也可用已知抗原检测标本中有无相应抗体。,这种特性就是许多免疫检测方法的基础!,一、体外抗原抗体反应的特点,特异性：抗原抗体反应具有高度的特异性。 可逆性：抗原抗体反应所形成的复合物较稳定， 但在一定条件下可解离。（低酸、高盐） 比例性：抗原抗体的比例合适，才可出现可见的 反应现象。（网格理论） 阶段性：特异性结合阶段和可见反应阶段。,网格理论解释抗原抗体形成沉淀的机制,网格学说（lattice theory）,抗体过剩,抗原过剩,抗体抗体比例合适,抗原,抗体,二、影响抗原抗体反应的因素,温度：在一定温度范围内，提高温度可加速反应 速度，缩短反应时间，常用反应温度为3
3、7-45。 溶液的pH：pH过高或过低可改变抗原和抗体理化 性质，影响反应结果，因此溶液的pH应适宜 （pH 6-8）。 电解质：反应中必须有适宜的电解质（0.85%NaCl） 参与，否则不出现可见反应。,三、抗原抗体反应类型,1.沉淀反应 2.凝集反应 3.补体参与的反应 4.中和反应 5.免疫标记技术,第二节 常见免疫检测方法,可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。,一、免疫沉淀反应,一、免疫沉淀反应,1. 液相沉淀反应,2. 凝胶扩散沉淀,3. 凝胶免疫电泳,絮状沉淀,环状沉淀,免疫浊度沉淀,单向琼脂扩散试验,双
4、向琼脂扩散试验,血清免疫电泳,火箭电泳,对流免疫电泳,免疫印迹等,絮状沉淀试验,操作步骤： （1） 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。 （2） 各管加入一定浓度的适量抗血清。 （3） 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37孵育。 （4） 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，目前 多用以测定抗原抗体反应的最适比。,环状沉淀试验,操作步骤： （1） 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（550mm）底部，避免产生气泡。（已知！） （2） 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（待测！ ） （3） 置沉淀管于室温下使其反应，
5、15min内在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。 应用：主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。 （诊断炭疽的Ascoli实验、细菌分型、血迹鉴定）。,2. 凝胶扩散沉淀,凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的扩散部位相遇形成沉淀线的反应。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。 最常用的方法为： 单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验,单向琼脂扩散试验,原 理： 将适当浓度的抗体混入琼脂凝胶中，琼脂 凝固后，打成小孔，加入待测的抗原物质， 使抗原在凝胶中由小孔自由向周围扩散，并 在小孔周围合适的位
6、置与抗体结合形成沉 淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。,单向免疫扩散试验示意图,双向免疫扩散试验,双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离 打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原 和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩 散，在两孔间可出现23条沉淀线，本法常 用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于 两种抗原材料的抗原相关性分析。,3.免疫电泳技术,免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。 这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度， 二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分 开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。 免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、 火箭电泳、免疫印迹等
7、,血清免疫电泳,将抗原混合物（病人血清）在凝胶中用电泳 分离后，沿电泳方向挖一平行的小槽，加入 抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示 病人血清与正常人血清存在的差异，即血清 蛋白组分的缺少或增加。,免疫电泳原理图解,火箭免疫电泳,火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散 免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起 来的一项定量技术，实质上是加速度的 单向扩散。,沉淀线的高度与抗原量成正比,火箭电泳图,二、凝集反应（Agglutination）,颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解 质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块 称为凝集反应。 1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应
8、，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。 2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。,妊娠免疫诊断试验,孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（HCG）含量明显增高。（HCG是可溶性抗原 ） 反之，非孕妇尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗体。,三、补体结合实验,（2个系统，5种成分）,已知抗原加入血清（检测抗体）,加入标准量补体,加入包被抗体的红细胞,检测红细胞溶解情况,Ag,Ag,三、补体结合实验,（2个系统，5种成分）,免疫标记技术是采用酶、荧光素、放射性核素等标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反应。 免疫标记技术既可对样品作定性、定
9、量检测，也可进行定位分析，且大大提高了方法的灵敏度，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。,四、免疫标记技术,常见标记免疫技术,放射免疫技术 酶免疫技术 荧光免疫技术,四、免疫标记技术,该法是用放射性核素作为标记物标记抗原或抗体 所进行的抗原抗体反应，尽管放射免疫技术需特殊 仪器设备且有一定的放射性危害，但由于其具有高 度的灵敏度（pg）和自动化检测等特点，因此在实 验研究和临床检测中仍被广泛应用。 主要用于激素、小分子药物、肿瘤标志物等 小分子化合物的定量分析。,1. 放射免疫技术（125I）,放射免疫分析基本原理,竞争性结合反应的经 典标记抗原（Ag*）和 非标记抗原（Ag）与限 量抗体(Ab
10、)竞争性结合 Ag*和Ag具有等同的 与Ab结合能力,放射免疫测定法(RIA)示意图,RIA法原理及标准曲线,75,50,30,10,0,1,10,100,1000,未标记抗原浓度（ng/mL),结合/未结合的放射活性（%）,Ag*-Ab,Ag*,将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体， 制成荧光抗体诊断试剂。 用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断 抗原的存在、定位和分布情况。 免疫荧光技术有直接法和间接法等。,2. 免疫荧光技术,免疫荧光技术直接法,免疫荧光技术间接法,免 疫 荧 光 染 色 显 示 细 胞 骨 架,免疫荧光染色是利用抗原抗体特异性结合的原理，用经荧光染料标记
11、的抗体对细胞或组织内的蛋白质进行定性或定量研究的方法。该技术与荧光显微镜观察相结合，可对特定的蛋白质进行细胞或组织内的精确定位。,常用于抗原、抗体标记的荧光染料有以下几种 显示绿色荧光：Fluorescein isothocyancie(FITC),Alexa-488 显示红色荧光：Rhodamine B, Texas Red, Alexa-546,568,594 显示蓝色荧光：Alexa350,用Alexa488标记的抗人-tubulin抗体染色显示微管(绿色); 细胞核: 红色, DAPI染色,人皮肤角化细胞免疫荧光染色,用抗-tubulin抗体染色显示微管(绿色); 细胞核: 红色, D
12、API染色(激光共聚焦显微镜照片),PtK1细胞免疫荧光染色,本法是抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催 化活性相结合的免疫检测技术。酶标记的抗原或抗 体与待检标本中的相应成分特异性结合，根据酶作 用底物后的颜色变化，采用肉眼或酶标检测仪分 析、判断结果。 常用方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前 者用于检测可溶性抗原或抗体，后者常用于检测组 织中或细胞表面的抗原。,3. 免疫酶测定法,是在固相载体（通常为聚苯乙烯反应板）表面进行 的抗原抗体反应。 实验中常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP），底物 为二苯基联苯胺。,酶联免疫吸附试验（ELISA）：,ELISA试验三个必要的试剂,(1)固相
13、的抗原或抗体（免疫吸附剂） (2)酶标记的抗原或抗体（标记物） (3)酶作用的底物（显色剂）,底物显色 定性或定量的分析,原理,包被,反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体,洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离,1,2,3,4,基本步骤,五种常见的检测方法,1 双抗夹心法（测定抗原） 2 测定抗体的间接法 3 竞争法（测定抗原） 4 捕获包被法测IgM抗体 5 ABS-ELISA法,适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及低于二价的小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心,1 双抗夹心法测抗原,2 间接法测抗体,几种标记/检测技术灵敏度的比较,酶标,荧
14、光,放免,发光,灵敏度(mol/L),10-18 10-15 10-12 10-9,几种标记/检测试剂的有效期比较,酶标,荧光,放免,发光,有效期（月）,18 15 12 9 6 3 0,人民币,人民币,三种免疫测定技术的成本及费用,三种免疫测定技术的成本及费用,放免,酶标,发光,A.将Ab吸附在固相载体表面; B. 加入酶标Ag和待测Ag，竞争结合Ab； 对照只加入酶标Ag； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知Ag量。,3 竞争法测定抗原,血清标本中的IgM包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM 加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合 抗人IgM抗体包被 加
15、入血清标本 加入特异性抗原试剂 加入针对特异性抗原的酶标抗体 加底物显色,4 捕获包被法测IgM抗体,捕获法,原理： 抗人IgM链抗体包被 捕获待测标本中IgM类抗体 加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体 底物显色,ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。 亲和素是一种糖蛋白，生物素为小分子化合物。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。 1个亲和素分子可与4个生物素分子结合。 因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可提高ELISA的敏感度。,5 ABS-ELISA法,ABS-ELISA法,：固相支持物； ：样品； ：特异性IgG； ：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； ：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）； ：DAB显色液； ：显色；,
