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1、.,第六章 一般毒性作用,根据接触毒物时间的长短，可将产生的一般 毒性作用分为急性毒性、亚慢性毒性和慢性 毒性。 按毒物接触时间长短所进行的观察和评价毒 效应的试验即为急性毒性试验、亚慢性毒性 试验和慢性毒性试验。,.,6-1 急性毒性作用,一、概念 急性毒性(acute toxicity)：指机体（实验动物或人） 一次或24小时内多次接触外源化学物后在短期内 所产生的毒性效应。包括一般行为和外观改变、 大体形态变化及死亡效应。,注意： 1.急性接触的次数：一次或24h内多次。 2.中毒效应出现的时间：一般为714天。 3.中毒效应的强度。,.,二、急性毒性试验的目的 1. 测试并求出毒物的的
2、致死剂量以及其他急性毒性 参数，通常以LD50为最主要参数，并根据LD50的 大小进行急性毒性分级。 2. 通过观察动物的表现、毒作用强度和死亡情况， 初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂 量反应关系和对人体产生损害的危险性。 3. 为亚慢性、慢性毒性试验研究以及其他毒理试验 提供接触剂量和观察指标选择的依据。 4. 为毒理学机制研究提供线索。,.,三、急性毒性试验方法要点1实验动物的选择,（1）原则 （2）具体要求 （3）实验动物的性别：雌雄各半。 （4）实验动物的分组与数量：一般46组， 每组10只。 （5）实验动物的预检：12周的检疫期。 （6）实验动物的给药前禁食处理 大鼠、小鼠
3、：隔夜禁食（禁食4h）；染毒后禁食4h。 禁食时要保障饮水。,.,尽量选择对化学毒物的代谢和毒效应表现 与人的反应尽可能一致的实验动物； 易于饲养管理、试验操作方便的动物； 繁殖生育力较强、数量较大能够保障供应； 价格较低，易于获得。,.,实验动物的物种和品系 首选哺乳动物，大小鼠最为常用。 大鼠：Spragur-Dawley（SD），Wistar 小鼠：昆明种，NIH，ICR 实验动物的年龄和体重：刚成年，且健康、未曾 交配和受孕的动物。 大鼠：180240克 小鼠：1825克 同一次试验、同一批实验动物的体重变异范 围不得超过其平均体重的20。,.,常用剂型： 水溶液；混悬液；油溶液。 试
4、验前新鲜配制。 受试物染毒量规定： 小鼠0.2ml/10g，一次灌胃体积不超过1.0ml/只 大鼠1.0ml/100g，一次灌胃体积不超过5ml/只 3染毒方法 灌胃,2受试物及处理,试验所用受试物的总量应一次备齐，且应 为同一批号。 受试物成分与配方应稳定不变。,.,4剂量选择与分组 5毒性作用观察 中毒体征及发生过程； 死亡情况和时间分布； 体重； 病理检查。 6观察时间和周期 观察时间：染毒当天应连续或多次观察，以 后每天2次或多次观察直至试验结束。 观察周期：一般是14天。 7. 计算LD50,.,(1)查阅文献 了解化学毒物的理化特性，生产批号及纯 度，杂质成分与含量等。 确定使用哪
5、一种计算方法求LD50，然后再设计剂 量分组。 LD50的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍恩氏法等。 找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学 物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系 和相同接触途径所测得的LD50值作为受试化学物的 预期毒性中值。,.,（2）预试验 设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组， 并在该剂量的上下各设计l2个剂量组作为预 试验剂量。 根据确定的剂量组进行染毒。 根据预试验的死亡资料确定组距。 可根据以下公式计算出剂量分组： i=(lgLD90-lgLD10)(n-1) 或：i=(lgLD100-lgLD0)(n-1) 式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量
6、之差)； n为设计的剂量组数。,.,（3）正式试验 根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定组数。 例如，几率单位法、寇氏法一般设510个剂量组； 霍恩氏法固定设4个剂量组。 求得i值后，以最低剂量组(LD0或LD10)的对数剂量 加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依 此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各 组剂量的真实值。 1 2 3 4 5 6 LgLD0 LgLD0+i LgLD0+2i LgLD0+3i LgLD0+4i ,.,.,死亡和死亡时间 重点观察和记录每只动物死亡的时间，特 别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组 动物的死亡数。,.,体重 在观察试验动物中毒症状
7、的过程中，应同时观察 体重的变化。 体重可以反映动物中毒后的整体变化。 体重改变的原因很多： *若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少 甚至拒食，表现为体重减轻； *若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也 会减轻； *如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能 在体重上反映出来。,.,寇氏法（Karbor）,1. 预试验：预试实验 取小鼠16只，随机分 成4组，组间剂量之比为2:1。记录各组动物 死亡率，粗略获得最大的不致死量（LD0） 和最大的致死量（LD100）。 2. 正式试验 动物数：除另有要求外，一般设510个剂 量组，每组610只动物为宜。,.,剂量确定：
8、在LD0与LD100之间按等比级数 插入几个中间剂量组。相邻剂量公比，按下式 计算：i= (lgLD100-lgLD0)(n-1) （1） n为欲分组数； 则各组剂量分别为下列各数值的反对数： lgLD0 lgLD0+i lgLD0+2i lgLD0+3i lgLD0+4i .。 设通过预试验，求得普鲁卡因的lgLD0为164mg/kg, lgLD100为250mg/kg，准备分成5组进行实验，各组 剂量为多少？ 将以上数据代入公式（1）：i=0.046 故各组剂量分别为164，182，203，225，250mg/kg,.,给药及观察：取体重1822g小鼠80只， 随机分为5组，每组16只，按
9、上述求得的 剂量分组给药，腹腔注入盐酸普鲁卡因， 观察并记录死亡百分率。 结果记录 (只) 剂 量 D(mg/kg) LogD=X 死亡数(只) 死亡率(%) p 16 250 2.3979 15 94.0 0.94 16 225 2.3522 13 81.3 0.813 16 203 2.3075 8 50.0 0.50 16 182 2.2601 5 31.3 0.313 16 164 2.2148 1 6.3 0.063,.,LD50计算 寇氏法：LD50=log-11/2(xi+xi+1)(pi-pi+1) 改良的寇氏法： LD50=log-1Xm-i(p-0.5) ， 式中： Xm为
10、最高剂量的对数值 （log250=2.3979）； p 为各组动物的死亡率，以小数表示(如80%写作0.8)； p为各组动物死亡率的总和(p1+p2+p3+p4+p5)； i为相邻两组剂量(D)对数值之差，即： log250-log225=0.0457。 p=2.626 LD50=log-12.3979-0.0457(2.626-0.5) =200(mg/kg),.,四、急性毒性分级和评价,.,6-2 蓄积毒性作用,一、基本概念,1蓄积作用（accumulation）：外源性化学物质连续反复地进入机体，其吸收速度或总量超过代谢转化排出的速度或总量时，化学物质就可能在体内逐渐增加并贮留，这种现象
11、称为化学物质的蓄积作用。,2物质蓄积（material accumulation）：当实验动物反复多次接触化学毒物后可以用分析方法在体内测出其原型或代谢产物时，称为物质蓄积。,3功能蓄积（function accumulation）：化学物质长期接触机体后，机体内虽不能测出其原形的型或代谢产物，却出现了慢性毒性作用，称之为功能蓄积。,.,二、研究目的 蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重 要内容之一，目的是通过试验求出蓄积系数 K，了解化学毒物蓄积毒性的强弱，并为慢性 毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提 供参考。,.,三、研究方法,（一）蓄积系数法,1蓄积系数：是多次染毒使半数动物出现效
12、应或死亡的蓄积剂量ED50(n)与一次染毒使半数动物出现相同效应（或死亡）的剂量ED50(1)的比值。 KED50(n)ED50(1) KLD50(n)LD50(1),2实验方案 （1）固定剂量法 （2）剂量递增法 （3）剂量固定的20天蓄积法,（二）生物半减期法,蓄积系数法是一种以生物效应为指标，用经验系数（K）评价蓄积作用的方法，即将多次染毒与一次染毒所产生的毒性效应（或死亡）进行比较。,.,固定剂量法： 先求出LD50， 选取相同条件的40只动物，分为两组（染毒组 和对照组），每组至少20只，雌雄各半。 试验组在120l5 LD50的范围内选定一个 剂量，每日以固定剂量、定时和相同途径进
13、行 染毒,试验期间观察记录每组动物死亡数。 当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。 计算累积总接触剂量LD50(n)，根据公式计算 K值，按下表进行评价。 若接触剂量已累积达到5个LD50剂量，也可终止试验。,.,蓄积系数分级标准,.,剂量递增法：,在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止 试验，计算K值进行评价。一般来说，在试验第21天也可结束 试验，因为这之前如果动物没有死亡或死亡数不足一半，说 明其累积剂量已达5.26LD50，即K5。使用本方法时要注意 染毒期间定期(每4天一次)给动物称重，按实测体重，调整化 学毒物的染毒绝对量。,.,6-3 亚慢性和慢性毒性,一、亚慢
14、性毒性作用,1概念：亚慢性毒性（subchronic toxicity）是指实验动物或人连续较长期接触较大剂量的外源性化学物所产生的中毒效应。,2亚慢性毒性试验的目的 3亚慢性毒性试验的方法要点,.,研究受试物亚慢性毒性剂量反应关系，确定 未观察到有害作用的剂量（NOAEL）和可观察 到有害作用的最低剂量（LOAEL），提出安全 限量参考值。 观察受试物亚慢性毒作用特点和毒作用靶器官。 观察受试物亚慢性毒性作用的可逆性。 为慢性毒理试验的剂量设计和观察指标选择提供依据。 为受试物毒性机制研究和将研究结果外推到人提供依据。,.,（1）实验动物的选择,物种和品系 一般要求选择两种实验动物： 啮齿类
15、（大鼠：Wistar和SD） 非啮齿类（犬：Beagle犬）,性别、年龄和动物数 两种性别，雌雄各半； 初断乳动物，大鼠68周龄，体重80100g； 大鼠每组不少于20只，犬、猴每组不少于6只。,微生物学、寄生虫学等级和饲养环境 亚慢性毒性试验要求大鼠应使用清洁级及以上等级，并饲养在屏障环境内进行试验。,.,（2）染毒方式 应尽量选择与人接触途径相似的方式； 应与预期进行的急性毒性试验的接触途径相 一致。 染毒频率多为每日一次，连续90天。 在进行食品安全性评价时一般采用经口染毒 途径。 有三种方式：灌胃法、喂饲法、胶囊法。,.,剂量设计的原则： 最少设三个剂量组和一个阴性（溶剂）对照组。 高
16、剂量组应能引起明显的毒性或少量动物 死亡（少于10）； 低剂量组应无中毒反应，相当于未观察到 有害作用剂量（NOAEL）； 理想的中剂量组约相当于观察到有害作用 的最低剂量（LOAEL）。,剂量设计 高剂量：1/20LD501/5LD50 三个剂量组间的组距应为310倍，不少于2倍。 以实际摄入量的100倍作为其中一个剂量。,（3）剂量选择和分组,.,（4）观察指标 一般指标： * 外观体征、行为活动； * 动物体重； * 饲料消耗量 实验室检查： * 血液学检查：血液学常规指标 * 血液生化学检查 系统尸解和组织病理学检查 * 脏器重量和脏器系数 * 病理学检查 其他指标,.,4. 亚慢性毒性评价,最大无作用剂量小于或等于人的可能摄入 量的100倍者表示毒性较强，应放弃该受 试物用于食品。 最大无作用剂量大于100倍而小于300倍者，
