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1、人巨细胞病毒（HCMV）荧光定量PCR检测试剂盒说明书 V.070528 1 / 3 人巨细胞病毒（HCMV）荧光定量PCR 检测试剂盒说明书 人巨细胞病毒（HCMV）荧光定量PCR 检测试剂盒说明书 【产品名称产品名称】 通用名称：人巨细胞病毒（HCMV）荧光定量PCR检测试剂盒 英文名称：HCMV PCR Fluorescence Quantitative Detection Kit 【包装规格包装规格】 48 人份/盒 【用途用途】 本试剂盒用于人尿液或痰液中人巨细胞病毒核酸（HCMV DNA）的定量检测。 【检验原理检验原理】 本试剂盒选用人巨细胞病毒株（即人疱疹病毒 5 型）-AD1
2、69 基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的 IE 基因的一段高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针；利用实时荧光定量 Taqman 探 针法并结合竞争性内标技术，来定量检测人尿液或痰液中人巨细胞病毒核酸（HCMV DNA）的拷贝量。本试剂 盒可用于临床对人巨细胞病毒的辅助诊断和抗病毒药物的疗效观察。 【主要组成成份主要组成成份】 工作标准品 1-4 的参数因批号而异，详见试剂盒盒内标签。工作标准品 1-4 使用已获国家 SFDA 批文的 HCMV 定量检测试剂盒标定的企业质控品进行标定。 【储存条件及有效期储存条件及有效期】 1） 试剂盒必须在冷冻条件下运输。 2） 试剂盒保存
3、：试剂盒须-20以下保存，应避免反复冻融。 3）有效期：本试剂盒有效期 12 个月，请在有效期内使用。 试剂盒组成 数量 成份 试剂盒组成 数量 成份 浓缩液 A 4.8ml1 含有 PEG8000 的溶液 样本 提取 样本 提取 裂解液 B 960l2 含有 Tris 碱缓冲液 HCMV PCR 反应液 835l2 含有引物、探针和 dNTP 的溶液 Taq 酶 (5U/l) 14.4l1Taq 酶 UDG 酶 4.8l1 UDG 酶 核酸扩增试剂 核酸扩增试剂 内标 48l1 含有适量的非 HCMV 基因片段的非传染性 DNA 阴性对照品 200l1 HCMV DNA 阴性的混合尿样 临界
4、阳性对照品 200l1 含有约 10 3Copies/ml 的 HCMV 基因片段的非传染性 DNA 对照品 对照品 强阳性对照品 200l1 含有约 10 6Copies/ml 的 HCMV 基因片段的非传染性 DNA 工作标准品 1： （1-5）10 7Copies/ml 40l1 含有约 10 7Copies/ml 的 HCMV 基因片段的非传染性 DNA 工作标准品 2: （1-5）10 6Copies/ml 40l1 含有约 10 6Copies/ml 的 HCMV 基因片段的非传染性 DNA 工作标准品 3:（1-5）10 5Copies/ml 40l1 含有约 10 5Copie
5、s/ml 的 HCMV 基因片段的非传染性 DNA 工作标准品 工作标准品 工作标准品 4: （1-5）10 4Copies/ml 40l1 含有约 10 4Copies/ml 的 HCMV 基因片段的非传染性 DNA 人巨细胞病毒（HCMV）荧光定量PCR检测试剂盒说明书 V.070528 2 / 3 【适用仪器适用仪器】 博日公司恒温金属浴系列或水浴和 Line-Gene 系列荧光定量 PCR 检测系统及其他厂家同类荧光定量 PCR 检测系统。 【样本要求样本要求】 1 样本采集：用无菌的干燥玻璃管取受检者晨尿 10ml，即为尿液标本。痰液使用一次性痰液收集器采集， 最好留取早晨第一口痰液
6、。痰液收集后应尽快送检。在痰液标本中加入两倍体积生理盐水溶液(自备)， 混合均匀。 2 存放：待测标本保存于-20，但应避免反复冻融。 3 运输：标本运输应采用泡沫盒加冰袋。 【检验方法检验方法】 (一)(一) 标本提取标本提取（在标本处理区进行） 取待测尿液或液化痰液 100l， 加到 0.5ml 离心管中； 加入 100l 浓缩液 A， 振荡混匀， 13,000rpm 离心 10min；吸弃上清。注意：尽可能吸弃上清且不碰沉淀注意：尽可能吸弃上清且不碰沉淀；加入 40l 裂解液 B，剧烈振荡，100干 浴或沸水浴 10min；13,000rpm 离心 10min，保留上清备用。此提取液保存
7、于-20。 （二）PCR 反应液配制PCR 反应液配制（在试剂准备区进行） 1 试剂配制：将试剂盒中的 HCMV PCR 反应液、工作标准品及对照品进行室温解冻。试剂配制前，将所有试 剂振荡后短暂离心。按标本的数量（n 个）加上工作标准品（4 个） 、对照品（3 个）和阴性（1 个）的数量 进行 PCR 反应配制（n+8）个，配制方法如下： 试 剂 PCR 反应液 内标 Taq 酶 UDG 酶 单人份用量 34.6 l 1l 0.3 l 0.1l 配制量 （n+8）34.6 l（n+8）l（n+8）0.3 l（n+8）0.1l 混合好上述反应液后，以每管 36l 分装于（n+8）个 200l
8、的 PCR 反应管中。 2 加样：分装好的反应管分别加入已提取好的标本、对照品及工作标准品各 4l。 3 PCR 反应 反应程序设置如下： 37：5 分钟； 94：1 分钟； 94：5 秒； 60: 40 秒； 仪器检测通道选择:荧光信号收集设定为 F1（FAM） 、F2（HEX）通道。 Line-gene 系列荧光定量 PCR 检测系统运行之前，设置程序在 60运行 10 秒，检测荧光本底值，调节增益 使荧光 F1、F2 通道本底值在 20-30 之间。 【质量控制质量控制】 1 标准曲线的相关系数绝对值大于等于 0.970，阴性对照品的 Ct 值应不显示或为，强阳性对照品的 HCMV DN
9、A 拷贝量应为 1104 9 106 Copies/ml,临界阳性对照品的 HCMV DNA 拷贝量应为 1102 9 103 Copies/ml， 否则实验视为无效。 2 内标 Ct 值应小于等于 36，实验视为有效。如果检测结果中内标 Ct 值大于 36 时，可判定 PCR 检测受到抑 制，建议样本重新测定或稀释后重新测定。 40 个循环 人巨细胞病毒（HCMV）荧光定量PCR检测试剂盒说明书 V.070528 3 / 3 【结果分析与判定结果分析与判定】 1 Line-gene 系列荧光定量 PCR 检测系统 F2（HEX）通道分析：F2（HEX）通道选择样点拟合法进行分析， F2（HE
10、X）通道基线（零点调整）取为 2025 个循环的荧光信号，噪声容限自动，然后进行定量分析。 2 Line-gene 系列荧光定量 PCR 检测系统 F1（FAM）通道分析：将四个工作标准品的浓度输入，F1（FAM） 通道选择样点拟合法进行分析，F1（FAM）通道基线（零点调整）取为 1015 个循环的荧光信号，噪声容限 为基线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，然后进行定量分析。也可根据仪器 噪音情况另行调整。 3 检测样本中 HCMV DNA 的 Copies 数在 110 3Copies/ml 到 1108Copies/ml 之间时，可直接报告相应的 Copies 数
11、； 4 若检测样本中 HCMV DNA110 8Copies/ml，可直接报告为1108Copies/ml，也可用正常人尿液按 10 倍梯度做相应稀释，使其 Copies 数落在 110 51107Copies/ml 范围内再重新测定，测定结果应以稀释倍 数进行校正； 5 若检测样本 HCMV DNA110 3Copies/ml ，F2（HEX）通道 Ct 值小于 36 时：Copies 数仅供参考，建议 重新检测；若仍110 3Copies/ml，报告为小于最低检出限；若1103Copies/ml，报告相应的 Copies 数； 若 F2（HEX）通道 Ct 值大于 36 时：可判定 PCR
12、 检测受到抑制，建议样本重新测定。 6 F2（HEX）通道 Ct 值小于 36，F1（FAM）通道 Ct 值不显示时，报告为 0.0 Copies/ml。 【产品性能指标产品性能指标】 1 根据临床考核结果，本试剂盒的稳定检出灵敏度为 110 3 Copies/ml，线性范围为 1103 Copies/ml HCMV DNA110 8 Copies/ml。 2 本试剂盒的交叉反应性已经临床考核的检验而确定，EBV、HBV、HSV-1、HSV-2、腺病毒、金黄色葡萄球 菌、结核杆菌与本品无交叉反应，阳性结果可以排除疱疹病毒群中的其他属病毒。 3 本试剂盒的抗干扰性已经临床考核的检验而确定，高尿糖
13、、高蛋白、高尿胆原和高胆红素样本及血尿不 影响实验结果，但会对 F1 通道荧光本底值产生影响。 【注意事项注意事项】 1 在实验前，应详细阅读此说明； 2 实验操作应严格按照卫生部要求的 PCR 分区内进行，一般分为试剂准备区、样品处理区、PCR 检测区。各 区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染，实验后立即清洁工作台； 3 操作人员必须经过培训，合格后方能上岗； 4 分装有反应液的反应管应扣紧或装入密袋内再转移至样本区进行上样； 5 上样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖； 6 实验全过程必须配带一次性的 PE 或橡胶手套，扩增结束后不要打开管子，应密封丢弃于指定的容器内； 7 实验过程中要求十分的仔细小心，以保证实验的准确性。试剂盒应按含有传染性材料对待，用过的吸头 请直接打入盛有消毒液的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。结束后用 75%酒精清理实验工作台， 并用紫外灯照射，以防止实验室污染。 8 不同批试剂组份不得混用或互换。 【批准文号批准文号】 【生产企业生产企业】 杭州博日科技有限公司 地址：杭州市滨江区滨安路 1192 号 电话：0571-87774567； 传真：0571-87774303 邮政编码：310053 网址：
