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1、任务九 金免疫标记技术,知识目标,技能目标,素质目标,1.掌握金免疫标记技术原理和分类 2.了解标记物的制备 3.了解金免疫检测的临床应用,1.会金免疫标记物的制备操作 2.会熟练操作金免疫检测过程,树立严肃认真、实事求是、高度负责的科学态度，具有良好的职业素质和崇高的职业道德。,任务目标,任务对象,任务过程,复习提问,案例导入,讲解与示教,学生操作,讨论分析,评价、考核,课后思考题,教 学 环 节,2,30,2,10,40,5,1,患儿，女，11岁，间断发热1周，伴咳嗽3天。体温最高39。1度，病程第2天查血常规正常，诊断“呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素”3天，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发
2、性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致？ 如何快速诊断？,案例导入,斑点金免疫层析法演示,肺炎支原体诊断试剂盒,讲解与示教,二用采血针采指尖血,一洗净双手,四立即加1-2滴缓冲液,三将1滴指尖血滴入加 样孔,操作,步骤5：15分钟读 取结果,？结果,？结果,老师纠正 点评,学生操作,一位学生 操作演示,学生分组 再操作,讨论分析,胶体金标记技术 (Immunogold labeling technique) 是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。,讨论分析,胶体金标记技术,讨论分析,（一）金免疫检测原
3、理,胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。 胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。,讨论分析,Geobegan等将胶体金标记抗体用于普通光镜下
4、检测B淋巴细脑表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色。,Faulk和Taylor首创胶体金标记免疫电镜技术,胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金银染色及斑点金免疫渗滤测定法等多种标记免疫检测方法,1971年,1978年,近年来,讨论分析,讨论分析,枸橼酸三钠还原法,鞣酸枸橼酸钠还原法,根据不同 的还原剂 可以制备 大小不同 的胶体金 颗粒。常 用来制备 胶体金颗 粒的方法,胶体金的制备,1枸橼酸三钠还原法 （1）10nm胶体金粒的制备：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4，溶液呈红色。
5、（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。 （3）15nm、18nm20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、1820nm、30nm和50nm,讨论分析,2鞣酸枸橼酸钠还原法 A液：1HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。
6、B液：1枸橼酸三钠4ml，1鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。 将A液、B液分别加热至60，在电磁搅拌下迅速将 B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变 成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。如需 要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字 调整鞣酸及K2CO3的用量,讨论分析,（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。 （2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用
7、双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45m）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。,制备高质量胶体金的注意事项,讨论分析,（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。 （4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。 （5）氯金酸配成1水溶液在4可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。,制备高质量胶体金的注意事项,讨论分析,灵敏度不如酶标技术 一般作为定性，不易定量。,讨论分析,自带质控对照,简便、经济实用,符号显示结果,快速：全部检测过程 仅需 3-20分钟。,示踪剂：以胶体金为指示剂，本 身形成免
8、疫分析过程后的颜色标记,讨论分析,可单份检测，稳定性好,讨论分析,分类,双抗体夹心法,G区：金标特异性抗体(兔型),C区：羊抗兔Ig,T区：特异性抗体,吸水纸,标本,讨论分析,讨论分析,竞争法,标本,G区：金标特异性抗体(兔型),C区：羊抗兔Ig,T区：标准抗原,吸水纸,阳性结果,讨论分析,标本,G区：金标特异性抗体(兔型),C区：羊抗兔Ig,T区：标准抗原,吸水纸,阴性结果,讨论分析,讨论分析,斑点金免疫渗滤测定法（dot immunogold filtration assay,DIGFA）此法原理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。,讨论分析,以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结 合，再加胶体金标记的抗-HCG抗体，形成双抗体夹心复合 物（红色）,讨论分析,考核评分表 布置作业 1.实验报告,评价、考核,思考题,金免疫法能测出抗体，如 此简单、方便如何用荧光 免疫能检测出吗？，下一 次课学习荧光免疫检测， 预习相关内容,
