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1、前列腺癌的免疫组化标记物,发表时间：2013-5-13 来源：中外健康文摘2013年第10期供稿 作者：胡新梅 于民 姜敏,1 前列腺特异性抗原 前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)是分子量34000的单链糖蛋白，由237个氨基酸构成，它是一种丝氨酸蛋白酶，使凝固的精液溶解、液化。它是在1979年作为前列腺腺上皮细胞的标志物被发现的。血清PSA目前已被广泛应用于前列腺癌的早期筛查。,PSA在正常前列腺、前列腺增生、前列腺癌、前列腺上皮内瘤，均呈阳性表达，定位于上皮细胞的胞质中，而在前列腺转移癌则呈阴性表达，因此PAS阳性提示肿瘤来自前列腺上皮，可用于区
2、分前列腺癌与前列腺转移癌5。PSA在前列腺良、恶性病变中均呈阳性表达，故PSA不能用于鉴别良恶性病变。几乎所有的前列腺癌（除了分化最差的癌和少数激素治疗后复发的进展期癌以外）PSA标记都阳性，而高分化前列腺癌的PSA表达强于低分化前列腺癌, 表明PSA表达与分化程度有关。而对于分化很差的癌，即使PSA阴性也不能完全排除前列腺癌，还要结合其他检查综合考虑。偶尔PAS阳性可出现在前列腺以外的组织和肿瘤，但一般为局灶性弱阳性 6。,5Harvey AM, Grice B, Hamilton C, et a1. Diagnostic utility of p504s/p63 cocktail, pro
3、state-specific antigen, and prostatic acid phosphatase in Verifying prostatic carcinoma involvement in seminal Vesicles: a study of 57 cases of radical prostatectomy, speciments of pathologic stage pT3bJ. Arch Pathol Lab Med,2010,134(7):983-988. 6Bostwick D G, Qian J, Ramnani D M. Immunohistochemist
4、ry of the prostate and bladder, testis and renal tumors. In: Dabbs D J, ed. Diagnostic Immunohistochemistry. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2002.407-33,CK34El2,1984年，Gown等7首先报道了CK34El2，它是一种高分子量5700066000的细胞角蛋白。CK34El2标记良性前列腺组织，仅在前列腺基底细胞的细胞膜以及细胞质中表达，而不在前列腺分泌上皮细胞表达，故CK34El2可作为对前列腺的基底细胞层进行选择性的标记8
5、。由于基底细胞消失是诊断前列腺癌的重要形态学依据，而苏木素-伊红染色切片判断基底细胞是否存在常十分困难，因此用CK34El2标记基底细胞就成为前列腺良恶性鉴别诊断的重要手段之一。,在正常和良性增生以及上皮内瘤的前列腺腺体，导管周围形成连续或断续的CK34E12分布。而前列腺癌的腺体的基底细胞层完全消失，所以最终表现为CK34E12不表达。但CK34E12标记基底细胞可部分阴性，对经尿道电切的标本，常因标本经人为烧灼而受影响，因此可靠性和稳定性欠佳。有20%30%的前列腺癌导管腺癌和筛状癌周围有连续或间断的基底细胞，而部分良性前列腺病变,如腺病和不完全性萎缩的腺泡周围基底细胞可部分甚至完全消失。
6、说明基底细胞消失并非诊断前列腺癌的绝对指标。而免疫组化操作不当，则有可能出现假阴性结果而误诊。故免疫组化结果应结合HE切片中的其他形态学特征综合判断。,P63,1998年，Okada等9分离出新基因P63，P63是P53抑癌基因家族的成员，位于人类染色体3q27-29。P63能特异性地标记前列腺基底细胞，呈胞核阳性，棕黄色颗粒状，故而可以显示基底细胞的存在，而前列腺的分泌上皮细胞则呈阴性10。绝大多数的前列腺良性增生及低级别上皮内瘤的腺体的周围呈现连续性的P63分布；而高级别上皮内瘤可见P63不同程度的间断消失，而前列腺癌中腺体周围P63为阴性，显示基底细胞已经完全的消失。因此，P63也可用于
7、前列腺癌的鉴别诊断。,CK34E12、P63均可用于标记基底细胞，而作为诊断前列腺癌的有力手段。P63与CK34El2相比，具有以下优点：部分CK34E12标记阴性的基底细胞，P63标记可呈阳性；对有烧灼的经尿道电切的前列腺标本，P63标记结果比较稳定。P63标记基底细胞呈核阳性，结果容易判断，背景比较清晰。缺点则是其阳性表达是间断的，当可疑腺泡少时，判断其基底细胞是否消失有时比较困难。在实际应用中，两者具有互补作用。,基底细胞消失是前列腺癌的重要诊断依据，但局部的基底细胞缺失却不能作为诊断前列腺癌的唯一标准。由于前列腺癌可有残留的基底细胞，而且浸润性癌在管腔内扩散及良性腺体陷入癌组织中11,
8、因此个别前列腺癌中CK34El2与P63亦有阳性表达。少数前列腺增生病变基底细胞标记亦呈阴性表达，说明少数前列腺良性腺体基底细胞可以不连续或不能被证实存在，这也提示基底细胞免疫标志物阴性不能单独作为确诊恶性的指标。,-甲基-辅酶A-消旋酶 (P504s),2001年Jiang等12首次将P504s抗体应用于前列腺癌的诊断。P504s即-甲基-辅酶A-消旋酶(alpha-methylacyl-CoA racemase)，其基因定位于染色体5P13，它所编码的蛋白由382个氨基酸组成，在支链脂肪酸的-氧化和衍生过程中起作用。P504s在前列腺癌中高表达，而在正常中前列腺组织中则呈阴性或灶性弱阳性。
9、Jiang等在所检测的137例前列腺癌中阳性率高达100%，并提出P504s是前列腺癌高度敏感性和特异性的标记物。,P504s阳性，CK34El2和p63阴性，能从正反两面支持前列腺癌诊断，从而大大提高前列腺癌的诊断正确率13。然而，临床上并非所有的前列腺癌都是P504s阳性，CK34El2及p63阴性，也并非所有的前列腺良性病变都是P504s阴性，CK34El2及p63完整阳性。杨京哲14等人的试验中，P504s不仅在前列腺癌中有高表达，而且在前列腺上皮内瘤中也高表达，这表明P504s不但对前列腺癌敏感，并且对PIN也非常敏感，故用P504s只能区别前列腺良性增生，而不能把前列腺癌和PIN鉴
10、别开来。,2004版 WHO中， P504s在前列腺癌的阳性率为80%以上，但在某些前列腺癌如泡沫状腺癌、萎缩性癌、假增生性癌和治疗后前列腺癌中阳性率比较低。而且P504s在12%的良性增生，17.5%的前列腺腺病，萎缩型腺体以及90%以上的高级别PIN中呈阳性反应。此外，P504s在前列腺以外的肿瘤如尿路上皮癌、结肠癌、肾癌以及良性肾源性腺瘤也可阳性。这表明P504s没有组织特异性，不是前列腺癌的特异性标志物。,综上所述，免疫组化在前列腺癌诊断中的应用具有重要价值，但决不能完全依靠免疫组化去诊断前列腺癌，单独的P504s(或基底细胞标志物)阳性或阴性均不能确诊前列腺癌。只有将组织病理形态与免
11、疫组化染色结果结合起来，全面分析，综合判断，才能有效地避免误诊。,免疫酶细胞化学实验技术-实用免疫细胞与核酸技术（周德山）,免疫酶细胞化学是免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）中最常用的方法之一，它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学的手段，检测某种物质（抗原/抗体）在组织细胞内存在部位的一门新技术：即预先将抗体与酶连结，再使其与组织内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显微镜下观察分析的形态学研究方法。,为克服荧光抗体法的不足、并能在超微结构水平定位抗原物质的存在部位，Nakane(1966)等成功地引入了酶代替荧光色素标记抗体，进行组织细
12、胞内抗原或半抗原的定位，开辟了酶标抗体技术免疫酶细胞化学之路。 结合笔者经验，介绍ICC染色中的主要程序：组织标本的固定、切片、染色原理及步骤、结果判定及一些进展、特殊应用等供读者参考。,第一节固定和切片,一、固定 若想得到理想的ICC染色结果、正确地判断抗原物质在组织细胞内的位置，除需有良好酶和抗体外，保持组织细胞内抗原物质的不动性（Immobility）和免疫活性也是至关重要的。换言之，如果抗原物质在组织细胞间弥散、丢失或失去免疫活性，无论如何努力染色都是徒劳的，所以说固定是ICC染色中非常重要的一环。ICC与其它组织学技术不同，除要求保存良好的结构外，还需保存组织抗原的免疫活性。一般认为
13、，新鲜组织能够最大限度地保存组织抗原的免疫活性，但结构较差，易出现抗原弥散丢失现象。,Cumming（1980）报告，不固定的组织切片ICC染色时，环鸟苷酸含量丢失80%以上。固定的目的是使构成组织细胞成分的蛋白等物质不溶于水和有机溶剂，并迅速使组织细胞中各种酶降解、失活，防止组织自溶和抗原弥散，保持组织细胞的完整性和所要检测物质的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的关键一步。用于ICC的固定剂种类较多，选择时应根据所要检测物质的抗原性质和切片方法以及所用抗体特征等做最佳筛选。制片及固定方法见第一章，下面介绍两种近年报道的新方法。,1AMEX（Acetone Meth Enzoate X
14、ylene ）法 是改良的冰冻置换法（freeze substitution）的简称，主要用于石蜡包埋标本。Sato(1986)报告，该法具有同新鲜（未固定）组织冰冻切片同样的抗原保持性和石蜡切片的良好组织结构保存。其机制为：组织在丙酮中固定（脱水），组织细胞内水份逐渐被丙酮取代，继之，用苯甲酸酯取代组织内丙酮，经二甲苯置换后，石蜡包埋。组织在-20丙酮内过夜亦形成冰晶，所以原方法将组织先置4丙酮2030min，再移入-20丙酮过夜。实际上组织在4丙酮内过夜亦可得到同样效果。如在该固定液内加入少量蛋白酶活性阻断剂，并采用低溶点石蜡包埋等，可获得更佳染色结果。,微波固定（Microwave fi
15、xation）,为近几年所注目的问题之一。该方法能保持良好的组织结构和抗原性，适于各种切片的酶组化、ICC以及免疫电镜等材料固定。其固定机理可能与微波（频率10003000MHz）具有被水分吸收的性质（通常所用的微波是频率2450MHz，波长12cm）；生物材料含有大量水份，照射后，温度升高，分子运动加快，促进固定液向组织内渗透，加速与组织成分的反应，短时间内达到固定的效果等有关。经微波照射固定的组织，需置相同固定液中，继续固定26h，室温。,二、切片,光镜ICC染色，常用的有冰冻切片和石蜡切片两种，二者各有其优缺点，应根据抗原的性质、实验室条件，合理选择之。对未知抗原显示时，最好同时应用。冰
16、冻切片为ICC研究所首选。,Shi（1991）等报告：微波炉照射的切片，能够激活部分核内抗原活性。其机制不清，可能与高温、高热的作用，使核内DNA双链解开，DNA、RNA解离，抗原暴露有关。其步骤为：将切片脱蜡水洗后，置染色瓶中，加入去离子水或缓冲液至瓶颈处，反复多次照射，每次1min，照射510次，每次照射后，补充瓶中蒸发掉的液体，照射温度不超过9095为宜。此处理后，细胞核染色以苏木精为佳,第二节染色方法,一、本科标抗体法 酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。,（一）酶的种类及特点 从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体，进行ICC染色，但实际上在ICC中所能用的酶并不多。现将常用的几种酶列于表4-1，供选用时参考。,Sternberger(1986)指出，用于标记的酶应具备以下几点酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察；所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产
