《用酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质相互作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《用酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质相互作用（80页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、用酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质相互作用,蛋白质之间相互作用研究的重要性,蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。 几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。,研究蛋白质相互作用的常用方法,酵母双杂交（yeast two hybridization） 亲和层析 免疫共沉淀 蛋白质交联 基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法 噬菌体显示系统筛选,酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物
2、敏感地检测得到。,第一节 酵母双杂交系统简介,它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。 该技术既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。,一、酵母双杂交系统的建立和基本原理,经典文献出处,Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 1989, 340(6230):245-246,（一）酵母双杂交系统的建立,1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yea
3、st two-hybrid system)。 该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：,转录激活因子,DNA结合结构域(BD) (DNA binding domain),转录激活结构域(AD) (activation domain),这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。,Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的
4、多肽链。 两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的1147位多肽构成，能识别位于Gal4基因的上游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。 此外，在其N-端还具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768881位多肽构成。 当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。,Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。 其中，SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一个结合蛋白
5、，这两种蛋白是已知可以相互作用的。,当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近, 形成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。 Gal4的DNA-BD可识别位于Gal4效应基因的UAS，并可与之结合； Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合，激活UAS下游报告基因LacZ的转录。,酵母转录因子（Gal 4）,与BD-fusion -诱饵（bait） 与AD-fusion -猎物或靶蛋白（prey or target protein）,报告基因（reporter
6、 gene） -Lac Z（编码-半乳糖苷酶）,（二）酵母双杂交系统的原理,transcription,酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有 许多优点: 易于转化、便于回收扩增质粒 具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相 互结合,报道株,经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞。,基因组中GAL4基因是缺失型的 基因组中引入额外的报告基因LEU、TRP、 HIS,改造后的酵母细胞的特点：,通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落,表达“诱饵”和“猎物”蛋白； 检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因。 做法：首先构建能表达“诱饵”和“猎物”
7、蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。,二、酵母双杂交系统的基本策略,三、酵母双杂交系统的优点,高敏感性。 原因： 采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达； 激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定； 通过mRNA使信号放大； 检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。,三、酵母双杂交系统的优点,高敏感性。 真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。 简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。
8、 广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。,分析已知蛋白之间的相互作用 对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。 用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。 分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。 绘制蛋白质相互作用系统图谱 在药物设计中的应用,四、酵母双杂交系统的应用现状,利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质 的新功能,将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与
9、诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。,利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可研究抗原和抗体之间的相互作用，但它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。,利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和 抗体的相互作用,利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及 药物对蛋白质之间相互作用的影响,对于能够引发疾病反
10、应的蛋白相互作用可采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。,利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图 （Genome Protein Linkage Map）,基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列。 利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。,五、酵母双杂交系统中常见问题的解决和改进措施,（一） 假阳性较多,（二） 转化效率偏低,（三） 阴性干扰,假阳性定
11、义 在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活。,（一） 假阳性较多,BD融合诱饵蛋白的单独激活作用。这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。 如AD融合靶蛋白有DNA的特异性结合，则可单独激活报告基因的表达。 AD融合蛋白直接与转录因子相互作用激活报告基因； AD融合靶蛋白与BD相互作用或者AD与BD融合蛋白之间的相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。,原因：,排除假阳性的措施,作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。 采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。目前试剂公司已采用。 报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。 优化3-A
12、T(3-aminotriazole)浓度。适当增加浓度可减少假阳性。 进一步分析： 这种相互作用是否会在细胞内自然发生。 有些蛋白依赖于泛素的蛋白酶降解途径成员，它们具有普遍的蛋白间的相互作用。 一些实际没有相互作用的蛋白但有相同的模体蛋白也可发生相互作用。,酵母转化效率较细菌低4个数量级，转化成为双杂交技术的瓶颈。 办法：引进酵母接合型 a接合型和接合型（两者之间可，但自身不能形成二倍体）,（二） 转化效率偏低,接合型酵母细胞,cDNA文库,诱铒蛋白基因,多克隆位点,DNA-BD 载体,AD 载体,转化,转化,a接合型酵母细胞,筛选平板生长菌苔,筛选平板生长菌苔,同一个三重筛选平板,克隆（诱
13、饵与靶蛋白相互作用）,鉴定,-半乳糖苷酶,部分已商品化,（三）阴性干扰,融合蛋白的表达对细胞有毒性，该怎么办？ 应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体 蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。 蛋白在酵母中不能稳定地表达，或者不能正确地折叠，或杂交蛋白不能转入胞核。,两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。,原因：,酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的应用， 但仍存在一些局限性。,六、酵母双杂交系统使用注意事项,酵母双杂交系统局限性,某些诱饵蛋白具有自身激活性质。 -双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结
14、构域 某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位到胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系统。 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。,酵母双杂交系统局限性,有时DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位点，或破坏了融合蛋白的正确折叠。 4. 哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究 阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位特异性的抗体进行共定位研究。 双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验
15、手段来验证。,在酵母双杂交的基础上，又发展： 酵母单杂交-用于核酸和文库蛋白之间的研究 酵母三杂交-三种不同蛋白之间的互作研究 酵母的反向杂交-两种蛋白相互作用的结构和位点。,七、反向双杂交系统和三杂交技术,(一) 酵母单杂交系统(one-hybrid system),1993年，由Wang和Reed等相继创立发展出一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系。,Wang MM, Reed RR. Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast.
16、 Nature，1993，364(6433):121-126.,文献出处,酵母单杂交系统原理,在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNA Gal4结合位点。 该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。 靶DNA序列特异的结合蛋白(BDPX)与Gal4 P的激活结构域可融合形成融合体，BDPX与其特异DNA结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。,酵母单杂交系统原理,理论上，酵母单杂交系统可利用靶DNA序列，捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。 该系统不仅适用于识别转录因子，也适用于研究参与转录抑制和DNA复制过程的蛋白质。,待筛选的蛋白Y或BD结构域同AD结构域融合，蛋白Y上游序列或BD与待目的DNA序列结合，导致AD激活了报告基因表达。,酵母单杂交系统应用,确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。 分离编码结合于目的
