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1、1,琼脂糖凝胶电泳检测DNA,丁新伦 13067206406,2,【一】背景知识,凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术； 分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。 根据制备凝胶的材料: 琼脂糖电泳 凝胶 电泳 聚丙烯酰胺电泳,3,【二】实验目的,学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 检测碱裂解法提取质粒的结果 检测双酶切法鉴定重组质粒的结果 检测PCR法鉴定重组质粒的结果,4,【三】实验原理,（1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子
2、或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。,（2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,5,配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA 分子大小来确定。,6,（3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可判断DNA分子量大小和粗略估计样品DNA浓度。,7,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,8,【四】仪器、材料与试剂,质粒样品、酶切样品和PCR样品。 凝胶电泳系统和电泳图像分
3、析系统(凝胶成像系统)等。 琼脂糖、 1XTBE电泳缓冲液、溴化乙锭、 6X载样缓冲液 （ 6X loading buffer）和DNA分子量标准（ Lambda DNA / EcoRI + HindIII Marker ）等。,9,凝胶电泳系统,DYY-6C型 双稳定时电泳仪电源（北京六一） 输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V) 4-400mA(1mA) 240W,美国Bio-rad伯乐 小型水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell,10,凝胶成像分析系统,11,Lambda DNA / EcoRI + HindIII Marker（Ferments）,一个已知分子质量的
4、DNA样品做最对照，用来确定待测样品的相对分子质量。,12,常用电泳缓冲液,13,电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： 增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 使样品呈色，使加样操作更方便。,上样缓冲液,14,溴化乙锭,溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐EthidiumBromide，EB），EB染色（EB可很好地掺入到双链DNA中），在紫外光下会发出橙红色的荧光，用于对DNA进行染色和观察。 用于观察的紫外光有种波长，一般使用中波紫外光（）。 短波紫外光（）观察
5、效果较好，但对DNA的破环很大。 长波紫外光（）：回收。,15,16,17,EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。 SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。,18,【五】实验步骤,制备琼脂糖凝胶（1%） 制备凝胶板 加样 电泳 染色 结果观察,19,（1）制备凝胶和胶板： 45ml(1TBE)+0.4g琼脂糖（ 三角瓶 ）， 煮胶，溶解，冷却至60(不烫手)，倒板(4-6mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子 。 胶板设计（44人）： 每18孔胶板（5人X3样品+1marker），8胶板 每8孔胶板（2人X3样品+ 1marker ），2胶板,20,（2 ）加样： 5l质粒DNA+1l loading buffer ，混匀 15lPCR产物+3l loading buffer，混匀 10l酶切产物+2l loading buffer，混匀 6lDNAMark （每板胶加一孔） （3 ）电泳：电压3-5V/cm，约80-90V，注意电极方向 （4 ）染色：EB染色约15min （5 ）观察：紫外透射分析仪下观察。,21,22,23,24,25,26,【六】实验结果,
