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1、联科生物技术有限公司 CD34 细胞计数- 1 -/ 技术支持 电子邮件 免费电话8008282330 8008571184 传真电话86 512 68668874 C D 3 4 +细胞计数 外周血现已被广泛地被用作骨髓移植 癌症患者接受大剂量化疗或放疗后骨髓重建造所 需血干细胞Hemotopoietic Progenitor Cells HPC 的来源外周血源性干细胞现主要被运用 自体移植 其应用面也逐步拓展至异基因骨髓移植中 使用外周血替代骨髓作为造血干细胞 的来源有着以下优点1易采集2对供者无需全身麻醉3减少了采集后并发症的发 生4受者造血系统重建快5费用低6住院时间缩短或可部分或全部
2、在门诊处完成 操作 相对于骨髓 外周血中的造血干细胞一般只出现一次高峰 其数量取决于供者血体积和 /或单个核细胞的数量由于外周血中造血干细胞含量很低固常规中运用多极分离技术来 收集这些细胞在早期临床研究中收集的干细胞作为移植物数量是否足够很不清楚因为 要检测这些细胞数量需要使用集落形成实验 但此法明显不适用于临床 因其大致需要 12-15 天时间出结果 故无法满足临床中当天出报告决定移植是否继续的要求 此问题自发现CD34 抗体可鉴别造血干细胞并成功地被运用流式细胞仪定量检测造血干细胞后被圆满解决了 CD34+造血干细胞植活最低数量要求是 2-5 x 106/公斤体重然而正常人外周血中干细 胞
3、数量只占所有有核细胞的 0.1%很明显这些数量的干细胞是不足够运用于移植的除非 使用恰当技术增加外周血干细胞的含量供采集 此技术可通过给予供者集落刺激因子 通常 是粒或粒-单集落刺激因子同时可联合骨髓抑制剂如环磷酰胺的方法动员造血干细 胞进入循环外周血中联合使用化疗药物与集落刺激因子造成短暂的循环血中髓系细胞抑 制 随后使骨髓代偿性地释放髓祖细胞 造血干细胞至外周血 从而达到动员干细胞的目的 联合使用细胞毒药物与集落刺激因子可延长抑制时间 相对于单独使用集落刺激因子可增加 动员至外周血中的干细胞对于正常人供者不可使用化疗药物来抑制外周血常使用 G 或 GM-CSF血小板刺激因子来动员关于如何使
4、用动员药物请参见其他相关文献 早期外周干细胞计数 在尚未应用流式细胞仪定量检测 CD34+细胞时 外周血干细胞计数常运用单位-粒/巨噬 细胞集落形成实验间接求得 这项检测技术通过直接计数干细胞形所的集落来反映干细胞的 数量 故被认为是检测是否存干细胞的金标准 但也有学者置疑此检测是否与移植成活率有 很好的相关性因为在这项技术中各研究单位缺乏统一的检测标准刺激因子不同的处理 方法和不同的配伍使用集落形成后不同的计数方法都造成了统计数据具有很大的变异性 常规体外集落形成实验主要检测髓系祖细胞并要求大约 14 天取得结果使得该项检测无法 来确定临床何时采集干细胞所以以前只根据循环血中的最大集落数CF
5、U 而非 CFU-GM 来确定采集多少细胞 使用CD34识别造血干细胞 自从发现纯化标记抗 CD34 单克隆抗体开始使流式细胞定量检测在外周血或骨髓 中的 CD34 阳性造血干细胞成为了可能CD34 抗原存在于各种祖细胞上其中包括多能干 细胞和间质干细胞 在某些组织的上皮细胞上也有表达 CD34 抗原的分子量为 105-120KD 具有一个高度糖基化的类粘蛋白的结构 内皮细胞的 CD34 抗原与 L 选择素结合 然而造血 干细胞上的 CD34 抗原的配体至今还未发现有学者认为此抗原在细胞粘附中起作用通过 联科生物技术有限公司 CD34 细胞计数- 2 -/ 技术支持 电子邮件 免费电话8008
6、282330 8008571184 传真电话86 512 68668874 与不同特异性的 Vibrio cholera 神经氨酸苷酶和 Pasturella hemolytica 起源的糖蛋白酶作用可 区分出此抗原的不同位点这些位点根据其与不同的抗体结合情况可分为 III 和 III 类 最近有报道 I 和 II 类抗原应属同一家族 因为它们具有相似的抗原结构和功能属性 这些研 究都是基于交叉封闭实验的 故不可作为评价抗体结合效率或抗原空间结构之用 II 类抗原 位点具有由非糖基化氨基酸构成的线性申展结构 四周由在远 N 未端组成 CD34 的 I 抗原的 类糖酶结构环绕尽管 I 类与 II
7、 类抗原几乎合二为一但它们化学和物理性质是不同的 Siena 领导的工作组是第一个报道使用流式细胞仪定量检测 CD34+造血干细胞的含量 来决定动员干细胞及采集最佳时间并研究 CD33 在干细胞上的表达与移植效果的相关性 CD34 阳性细胞运用 SSC 与 CD34 双参数流式点图来检测在此项研究中发现所有的 CD34 阳性细胞均与形成 CFU-CM 集落相关并证实 CD34+细胞计数是决定干细胞采集时间有效 方法此外Fritsch 及其工作组发现 CD34 阳性细胞比例与外周血单个核细胞数量和 CFU-GM 和 CFUGEMM 检测的集落形成能力有相关性这些结果被其他学者相继证实并 使流细胞
8、仪成为定量检测 CD34+细胞成为监测动员干细胞和计数移植中造血干细胞数量的 有效精确的工具 尽管以前工作已证实造血干细胞表达 CD34 抗原 但鉴别多能干细胞的复杂工作才刚刚 开始Siena 及其工作组发现 CD34+CD33+双阳性细胞数量与早期移植成功有相关性同时 Tertappen 注意到骨髓中提取的 CD34+CD38-阴性的细胞在 IL-3IL-6 和 GM-CSF 刺激下能 够形成最原始的集落随着 CD38 抗原的增加CD34 阳性细胞形成这种原始集落的能力下 降在 CD34+细胞中CD34+CD38-表型的细胞占 1.0%左右随后又发现了其他细胞表面 抗原在识别多能干细胞中起着
9、重要作用对于绝大多数临床应用来说计数 CD34 阳性细胞 已足够为移植提供可靠 持久的参数 然而计数更为原始的多能干细胞能够提供其他重要的 信息所以有必要发展下面将叙述的技术来达成此目标此外可发现鉴别更新的一些干细 胞抗体来提供更为直接的检测方案如ACC-133 和 F84.1 在达到一个稳定 长期的移植成功的疗效中 CD34+阳性细胞最少需求量方面还存在争 议Bender 发现大约 2x106 CD34+细胞/公斤体重的剂量能够保证可靠的移植成功率在许 多病例中这个剂量很容易从动员的病人或正常人中收集到Bensinger 及其工作组发现 CD34+阳性细胞与血小板粒细胞重建时间有很强的相关性
10、并建议 CD34+细胞最佳剂量 是 5x106/kg一个对 692 例自体移植病例研究也得出了相似的结论 在移植前处理治疗中病人的耐受性及用药的强度等因素会造成以上情况Tricot 等观 察 225 例接受 PBPC 移植的病例和经 PBPC 输入治疗了难治性骨髓瘤患者 发现以上因素使 自体移植中 CD34+细胞的最佳剂量各不相同此研究表明对于移植前接受化疗少于 24 个 月的病人快速植活剂量应2.0 X 106 CD34+细胞/kg对于长期接受全身化疗的病人大于 24 人月最低剂量则为5.0 X 106 CD34+细胞/kg此处接受短期化疗的病人更容易快速 地取得 CD34+细胞总而言之这些
11、研究表达 2-5 X 106 CD34+细胞/kg 的剂量对于大多数 情况下是足够的但也有研究表明更高剂量的 CD34+细胞移植能够帮助病例更容易克服组 织相容性问题以下将要讨论有关 CD34+细胞的检测技术有些推荐剂量之间的差异正是 由于检测方案不同所引起的 CD34检测方案变异系数及其标准化 流式细胞 CD34 干细胞计数为成为应用广泛的实时检测 PBPC 是否足够移植的有效方 法对动员后供者循环外周血中 CD34+细胞绝对计数能够预测采集物中干细胞的数量并 越来越多地用来决定何时可开始采集干细胞 根据 CD34 阳性细胞在样本中的含量将决定是 联科生物技术有限公司 CD34 细胞计数-
12、3 -/ 技术支持 电子邮件 免费电话8008282330 8008571184 传真电话86 512 68668874 否继续给予生长因子刺激 采集是否继续 每次干细胞采集需要志愿者在护士的照顾下进行 3-4 个小时的干细胞分离过程采集的细胞在体外需要进行特殊的处理或进行低温保存从 治疗时间及消耗资源的意义上来说以上动员采集过程的费用是非常昂贵的对于有经济 困难的患者来说此部分的费用占了移植总费用的重要比例 在早期的研究中 干细胞动员方 案还未被应用 运用全部有核细胞计数作为移植物采集指标 有时会为单个病人采集相当于 现在 20 倍数量的细胞用于移植这不仅会增加标本保存成本还会带来病人体液过
13、量的临 床问题 CD34+细胞计数作为移植物采集量化标准解决以上所及的许多问题 但它也带来许 多新的疑问 米兰方案 第一个广泛应用的干细胞计数方案是由 Istituto Nazionale Tumori in Milan 的 Siena 等人 创立的米兰方案Milan Protocol在此方案中需准备三管 50 ul 的血样或 leukapheresis 样本如白细胞计数小于 150ul如受者样本则样本和抗体均需加倍其中一管留出不 作染色一管加入 15ul 的抗 CD34 和 CD33 抗体第三管则加入 15ul 的抗 CD2/CD19 抗体 计数 TB细胞细胞在 4下避光孵育 25 分钟之后
14、加入红细胞裂解液孵育 15 分 钟后加入不含钙 镁离子的 PBS 洗液 300g 离心 7 分钟洗涤 如果红细胞裂解不彻底则可重 复裂解过程弃上清后细胞可在 4保存并于一小时内上机检测在光散射参数中分析所有 细胞建立门圈定所有白细胞排除碎片并设立一门去除有自发荧光的细胞在调节完 补偿后分析 10000 个细胞CD34+细胞可通过低 SSC 信号和 CD34 阳性表达加以区分 CD34 弱阳性细胞一般不分析 目前有很多米兰方案的改进版分别从运用不同的 CD34 抗体不同的溶血技术加入其 他抗体来提高鉴别力变换荧光标记使用 CD45 抗体或其他核酸染料来更方便地鉴别白细 胞等方面进行改进运用这些技
15、术后报道的移植所需足够的并且能快速完成的 CD34+细 胞数量有着巨大差异 经过仔细研究发现这些差异是由于在 CD34 细胞计数过程中运用了不 同的标本处理染色和分析方法造成的因为在未动员的正常外周血中CD34 阳性细胞通 常小于全部有核细胞的 1%在经 G-CSF 动员后志愿者外周血中会大于 5%有时在用血小 板形成因子动员时可大于 20%对它们的精确计数对许多流式实验室是个重要的挑战 特别在计数小于 1%时又要做出检测来决何时进行采集时精确计数显得格外重要 Multi-Center方法研究报告 Multi-Center 研究所在北美欧洲澳大利亚所做的一系列研究使得在精确计数中存在 联科生物
16、技术有限公司 CD34 细胞计数- 4 -/ 技术支持 电子邮件 免费电话8008282330 8008571184 传真电话86 512 68668874 的储多问题逐步浮出水面 其中的一些问题最先在法国马赛招开的欧洲外周血干细胞计数研 讨会中提出在此次会议中讨论了临床的 CD34 计数的价值与在各种检测方案中所应用的 不同技术 并就外周血干细胞计数标准方案达成了一致 推荐方案中要求标本需预先作白细 胞计数用来染色的标本体积根据对 CD34+细胞数量估算来决定分析时要求收集足够的 有统计学意义的标本数量方案中推荐使用双标记方法染色其中包括将 2 ul 的 PE 标记的 CD3 抗体和 10ul 的 FITC 标记的 CD34 抗体QBEnd10加入 250ul 的全血进行染色室温 下孵育 20 分钟
