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1、紫外可见分光光度计,主要内容,1 仪器构成及原理 2 分光光度计的使用 波长扫描 定量测定 3 注意事项,一 仪器原理,紫外可见吸收光谱主要产生于分子价电子在能级间的跃迁。利用一定频率的紫外-可见光照射被分析的物质，引起分子中价电子的跃迁，它将有选择地被吸收。吸收光谱可以反映出物质的特征。,物质对光的选择性吸收溶液对光的作用,溶液对光的作用示意图,I0 入射光辐射强度 I 透射光辐射强度 T 透射比 a吸光系数 摩尔吸光系数,光吸收遵循朗伯-比尔定律：,溶液对光吸收示意图,溶液对光吸收过程,偏离朗伯比尔定律的原因-化学因素,朗伯-比尔定律的假设条件一： 入射光为单色光。 朗伯-比尔定律的假设条
2、件之二： 吸收粒子是独立的，彼此之间无相互作用。比尔定律适用于稀溶液。 吸光组分的化学变化： 吸光组分的缔合、离解，互变异构，络合物的逐级形成，以及与溶剂的相互作用等，都将导致偏离比耳定律。,组成：光源、单色器，狭缝、样品池、检测器 1光源： 能提供连续的辐射；光强度足够大；在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化；光谱范围宽；使用寿命长，价格低。钨灯可见光区 3202500nm 氢灯或氘灯紫外光区 195375nm,组 成,2单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件 单色器是分光光度计的心脏部分，它的作用是把来自光源的混合光分解为单色光并能随意改变波长。它的主要组成部件和作用是： 入射狭缝限制杂散
3、光进入。 色散元件即棱镜或光栅，是核心部件，可将混合光分解为单色光。准直镜把来自入射狭缝的光束转化为平等光，并把来自色散元件的平等光聚焦于出射狭缝上。 出射狭缝只让特定波长的光射出单色器。,3. 吸收池 玻璃由于吸收紫外UV光，仅适用于可见光区；石英适用于紫外和可见光区 4检测器：将光信号转变为电信号的装置 光电管 光电倍增管 二极管阵列检测器 5记录装置：讯号处理和显示系统,二 波长扫描,启动UV Solution软件,打开仪器主机电源。用鼠标点击Windows开始菜单中的Hitachi Applications选项中的UV Solutions 2.0 选项。或者直接在桌面上双击UV Sol
4、ution图标。,2运行UV Solution软件。软件将自动配置计算机的串行口（RS 232 Port）见图,仪器在初始化过程中进行如下自检工作： ROM检测 RAM检测 波长步进电机运转检测 氘灯点亮检测 钨灯点亮检测 仪器波长校正,3 仪器主机开始初始化。见图,仪器主机初始化完毕，进入工作状态。,测量参数设置,1 在Edit菜单中选择Method选项，或按按钮。出现下列窗口。,General:总体设置页面 Measurement测量: Wavelength scan 波长扫描 Time scan时间扫描 Photometry 定波长测量 Operator操作者: 输入操作者的姓名 Ins
5、trument仪器:仪器型号由软件自动从仪器主机获得。 Use Sample Table使用样品表:选择是否使用样品表。 Comments备注:填写一些备注信息。 Load按钮:用于装载原来保存的方法文件。 Save按钮:保存当前的设置参数。 Save As按钮:将当前设置参数另存为一个方法文件。,Instrument仪器参数设置页面,Data mode读数显示方式，选择Abs吸光度，波长扫描的起止范围一般为190-800，狭缝值一般为2 Light一般选择“Auto”,Monitor显示页面,Processing数据处理页面,Report报告结果页面,样品名设置，备注信息及文件名输入,基线校
6、正,用户基线校正方法：可将scan speed 设小一些；进行样品扫描时，可设大一些。 将空白样品分别放入样品室的参比光路和样品光路。按按钮 系统基线校正方法。 使用空气作为参比和样品。按按钮 出对话框见图，选择System后按OK按钮，进行系统基线校正。,测量,有两种方法可以开始测量： 使用菜单方式 选择Spectrophotometer菜单下Start选项开始测量 使用按钮方式 ：按按钮 开始测量 如果要终止扫描按按钮 。,二光度扫描,测量参数设置,在Edit菜单中选择Method选项。出现下列设置窗口.,具体操作程序,Method: general:Measurement测量方式选择Ph
7、otometry（光度计测量） Quantitation定量参数设置页面：,在measure中选择波长wavelength，在Calibration中选择“1st order”， “2st order”， “3st order”，也可以不校准。在concertration中键入标准浓度单位。 3. Instrument,4 standards标准参数设置 键入标系的样品浓度及名称,5 吸光度自动校零 在开始测试前，需要进行吸光度校零。在样品室参比和样品光路中分别放入空白样品。按按钮 进行吸光度校零。 6 在wavelength中设定扫描的最大吸收波长， 7 放入标样，选中第一个标样，点meas
8、ure依次测定完成 后自动给出标准曲线。 8 选择SAMPLE进行样品测定，全部测定完后点击END，此 时自动生成一个文件，打开此文件，另存为所需的文件名。 9 关机时，先退出UVsolution，再关电脑，最后关光度计上的power。,三 注意事项,1. 开机预热15分钟左右。 2. 测定时应注意： 参照池和吸收池应是一对经校正好的匹配的吸收池，材料和规格一致。 使用前后应将洗手池洗净，测量时不能用手接触窗口。 已匹配好的比色皿不能用炉子和火焰干燥，不能加热，以免引起光程长度上的改变。,3. 测量条件的选择： 选择适宜波长的入射光:由于有色物质对光有选择性吸收,为了使测定结果有较高的灵敏度,
9、必须选择溶液最大吸收波长的入射光。 控制吸光度A的准确的读数范围:由朗伯-比耳定律可知,吸光度只有控制在0.20.7读数范围内时,测量的准确度较高. 选择参比溶液：参比溶液是用来调节仪器工作零点的。若样品溶液，试剂，显色剂无色可用蒸馏水作参比溶液；反之应采用不加显色剂的样品液作参比溶液。 4. 用完后先关程序，再关仪器开关，关电源，关闭计算机。 5. 正确登记，将仪器及实验台擦干净。,谢谢大家,测 试 题,分光光度计由哪几部分组成？设计其光路图。 紫外可见分光光度计对光源的要求是什么？ 一般采用哪几种光源，各光源的波长范围是什么？ 比色皿一般由什么材料制成？有哪几种规格？做实验时，你是如何选择比色杯的规格及材料的？,为什么测定时使用参比池？参比溶液怎么选择？ 在进行波长扫描与光度测定时需要设置哪些参数？,
