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1、DNA分子的断裂和重新连接导致遗传信息的重新组合，称为重组（recombination）。重组的产物称为重组DNA（recombinant DNA），所有的DNA都是重组DNA。由于重组，一个DNA分子的遗传信息可以和另一个DNA分子的遗传信息结合在一起，也可以改变一条DNA分子上遗传信息的排列方式。DNA重组广泛存在于各类生物中，说明重组对物种生存具有重要意义。通过重组实现基因的重新组合使物种能够更快地适应环境，加快进化的过程。此外，DNA重组还参与许多重要的生物学过程，比如重组在DNA损伤修复和突变中发挥重要作用。,第一节：重 组,DNA重组包括同源重组（homologous recomb
2、ination）和位点特异性重组（site-specific recombination）。同源重组是更为普遍的一种重组机制，它可以发生在任何两种具有相同或相似序列之间，涉及到两个DNA分子在相同区域的断裂和重新连接。位点特异性重组发生在DNA分子特定的序列之间，需要特异性的蛋白质识别并催化特异序列之间的重组。位点特异性重组发生的几率相对较小。,一、同源重组（homologous recombination）,同源重组（homologous recombination）发生在两个同源DNA分子之间。真核细胞减数分裂过程中，同源染色体彼此配对，同源染色体DNA片段发生交叉与互换。这是发生在真核生
3、物中的同源重组。同源重组在接合、转导或转化后外源DNA整合到细菌基因组中。Robin Holliday提出的遗传重组模型是人们从分子水平上认识重组的基础。,First Meiotic Interphase (cells contain 4N DNA content),Bivalent sister chromatids align with each other, this act is termed synapsis. Synapsed sister chromatids are termed a synaptonemal complex),Figure 5-55, page 185,两条同
4、源DNA分子彼此并排对齐，相互配对DNA中两个方向相同的单链在DNA内切酶的作用下,在相同位置上同时切开。在切口处发生链的交换，形成所谓的连接分子（joint molecule），也称Holliday结构（Holliday structure）。分支点可以发生移动，称为分支迁移（branch migration），分支迁移的结果是在两个DNA分子中形成异源双链区（heteroduplex）。,1. Holliday model,链交换所形成的连接分子必须进行拆分，才能形成两个独立的双链分子。这需要再产生两个切口。反应结果要看切开的是哪一对链，如果切口发生在当初未切的两条链上，那么原来的4个链就
5、全被切开，就会释放出剪接重组DNA(splice recombinant DNA)分子。,如果切口发生在当初被切的两条链上，连接分子拆分后将形成补丁重组体（patch recombinant）。分开的两个DNA分子除保留了一段异源双链DNA 外，均完整无缺。因此，连接DNA分子无论如何拆分，所形成的两个独立的DNA分子总有一段异源双链区，但是异源双链区两侧的重组未必同时发生。,Synapsed chromatids,Recombination joint,Heteroduplex DNA,Holliday intermediates,A B,A B,A B,A B,Endonucleases
6、aka. resolvases (e.g. RuvC),Products before DNA repair,Holliday Intermediate (see Photo in Lehninger pg 962),Termed “patch recombinants”,2. Meselson-Radding,Matthew Meselson 和 Charles Radding对Holliday 模型进行了修改。Holliday模型要求在两个并排对齐的同源DNA分子的对应位点形成单链切口，从而产生游离的单链末端。然而，在Meselson-Radding遗传重组模型中，仅在一个双螺旋上产生单链
7、切口。利用切口处3-OH合成的新链把原有的链逐步置换出来，使之成为以5P为末端的单链区。随后游离的DNA单链侵入另一条DNA双螺旋中，取代它的同源单链并与其互补链配对形成异源双链区，被置换的单链形成D环（D-loop）。,D环单链区随后被切除,两个DNA分子在DNA连接酶的作用下形成Holliday交叉。与Holliday不同，此时只在一条DNA分子上出现异源双链区。如果发生分支迁移，在两条双螺旋上均出现异源双链区。随后发生的连接分子的拆解与Holliday模型一样。,3. 重组的双链断裂模型,DNA双链断裂（double-stand break, DSB）也会引发同源重组。根据该模型，重组时
8、两个彼此配对的DNA分子的中的一个发生双链断裂，而另一个保持完整。双链断裂后，在核酸外切酶的作用下，切口被扩大，并且形成2个3单链末端。其中一个单链末端侵入未打开的双螺旋的同源区，并取代其中的一条链，形成D环。随着侵入链被DNA聚合酶延伸，D环不断扩大，当D环的长度超过断裂DNA分子上被降解的区域，,断裂DNA分子的另一3单链末端就与D环的单链区退火，并作为引物被DNA聚合酶延伸。结果，断裂受体DNA分子上被降解的区域就以另一DNA分子上的同源区为模板得到了修复，同时形成两个分支点，分支点会沿着DNA移动，发生分支迁移。最终Holliday结构被拆分，形成两个独立的DNA分子，从而结束重组事件
9、。同样地，依据拆分Holliday结构时所剪切的DNA链，可以最终决定DNA分子重组位点两侧的基因是否发生交换。,Holliday 中间体是否真的存在？从细菌和动物细胞中可以分离出正在发生重组的质粒和病毒DNA。从它们的电镜照片上，我们可以发现与Holliday中间体类似的交叉和围绕着交叉点旋转形成的Holliday异构体。因此，无论重组的起始机制是什么，两个相连的DNA分子之间的交叉点都要发生迁移，并且Holliday结构要围绕交叉点发生旋转形成异构体。,4. 大肠杆菌的遗传重组,通过遗传分析，在大肠杆菌细胞中已经发现了3种重组途径，即RecBCD、 RecE、RecF途径。以下步骤为这3种
10、途径所共有：（1）产生一个具有3OH末端的单链DNA片段；（2）单链DNA侵入其同源双链DNA分子；（3）形成Holliday中间体，并发生分支迁移；（4）内切核酸酶对中间体进行切割，连接后产生重组体；（5）三种重组途径均需要RecA蛋白。,与Meselson-Radding模型一样，细菌中的重组也是由单链切口发动的。然而，在大肠杆菌中引发重组的单链末端是3-OH末端，而不是5-P末端。在这里我们主要介绍由RecBCD酶复合体发动的重组途径，这也是大肠杆菌中最重要的重组途径。,RecBCD具有多种酶活性，其主要的酶活性包括：ssDNA外切酶活性、dsDNA外切酶活性和解旋酶活性。解旋酶能够在S
11、SB存在情况下使双链DNA解螺旋。RecBCD与dsDNA的末端结合，然后以大约每秒1 000 bp 的速度解开DNA双链，同时降解解旋产生的ssDNA。RecBCD对两条单链的降解速度是不一致的，它优先降解3末端链。一个正在被RecBCD加工的DNA的末端会形成一个单链环和一个5端拖尾。,RecBCD的酶活性受重组热点Chi的调节。Chi位点大肠杆菌基因组中的一种不对称的8 bp核苷酸序列，5-GCTGGTGG-3，Chi位点能够改变RecBCD的酶活性，它是大肠杆菌重组过程的必需组分，是重组的热点。一旦RecBCD识别出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便发生变化，其35外切酶活性受到抑制
12、，53外切酶活性被激活，由原来优先降解3末端链，改变为只降解5末端链。但是它的解旋酶活性未受到影响。 RecBCD酶活性变化的结果是产生3末端带有Chi位点的ssDNA。,单链的侵入（strand invasion）由RecA蛋白介导。RecA是一种单链DNA结合蛋白，参与大肠杆菌中所有的同源重组事件。它催化一个双链DNA分子的3末端单链区侵入另一个双链DNA分子，形成异源双链区，同时置换出同源单链，形成Holliday结构。,RecA介导的链交换可以分为三个阶段：RecA聚集在ssDNA上形成丝状结构的联会前阶段；RecAssDNA丝装结构寻找同源双链DNA分子并与之配对的联会阶段，在这一阶
13、段可能形成三股螺旋（triplex）结构，入侵的ssDNA位于完整螺旋的大沟之中；发生链的交换，形成连接分子的阶段，入侵的单链置换出双链中的同源单链，产生一个长的异源双链区。,分支迁移和Holliday中间体的拆分 分支迁移由结合在Holliday分支点上的RuvA和RuvB蛋白催化。RuvA以四聚体的形式识别并结合到Holliday分支点上。RuvB蛋白为催化分支迁移的解旋酶，但RuvB自身不能有效地与DNA结合，它需要与RuvA一起起作用。RuvC蛋白催化断裂反应，切开极性相同的两条单链，拆分Holliday 中间体。,5. 真核细胞的同源重组,发生在减数分裂过程中的同源重组有两方面的重要
14、作用。一是确保同源染色体能够正确配对，而同源染色体的联会是生殖细胞形成时染色体数目减半的基础。另外，减数分裂重组也常常引起非姊妹染色单体之间的交换，结果是亲本DNA分子上的等位基因在下一代发生了重新排列。,减数分裂重组是由染色体DNA双链断裂启动的。在减数分裂的前期I同源染色体开始配对的时候，Spo11蛋白在染色体的多个位置上切断DNA。Spo11的切割位点在染色体上并非随机分布，而是多分布于染色体上核小体包装疏松的区域。Spo11蛋白由两个亚基组成，每个亚基上特异的酪氨酸分别进攻DNA分子两条单链上的磷酸二酯键，从而切断DNA，并且在断裂处形成磷酸酪氨酸连接，所以Spo11与拓扑异构酶及位点
15、特异性重组酶具有同样的性质。,在断裂处，MRX酶复合体利用其53的外切酶活性降解DNA，生成3单链末端，其长度通常可达1 Kb或更长。MRX酶复合体由Mre11，Rad50和Xrs2三个亚基组成，并以三个亚基的首字母命名。MRX酶复合体还被认为能除去与DNA相连的Spo11。,在真核细胞中已经发现了两种与细菌RecA蛋白同源的蛋白质：Rad51和Dmc1。这两种蛋白质在减数分裂重组中发挥重要作用。Rad51在进行有丝分裂和减数分裂的细胞中广泛表达，而Dmc1则仅在细胞进入减数分裂时被表达。依赖Dmc1的重组倾向于发生在非姊妹染色单体之间。减数分裂重组可能是通过促进同源染色体的交联，而帮助待分离
16、的同源染色体间的联会的。,除了鉴定出引起DNA双链断裂的Spo11、生成3单链末端的MRX以及介导链交换的蛋白质外，还发现了许多其他的蛋白质参与这一过程，例如，Rad52和Mus81。Rad52通过抵抗RPA的作用而启动Rad51蛋白丝的组装。因此，Rad52与大肠杆菌的RecBCD蛋白有相似的活性，RecBCD蛋白可以帮助RecA结合在原本被SSB所结合的单链DNA上，而Mus81蛋白可能是拆分Holliday中间体的酶。,二、位点特异性重组,位点特异性重组是发生在DNA上特定序列之间的重组，不依赖于DNA顺序的同源性，由能识别特异DNA序列的蛋白质介导，并不需要RecA蛋白和单链DNA。 噬菌体DNA侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生长和溶原生长的选择。要进入溶原状态，游离的噬菌体DNA要插入到宿主的染色体DNA中去，这个过程称为整合（integration）。由溶
