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1、Comprehensive design experiment , Nov 10,2016,综合实验之以-胰凝乳蛋白酶为催化剂在有机溶剂中合成N-保护的亮-脑啡肽三肽片段,1.原理 2.实验药品 3.实验步骤 (1) HClGly-Gly-OEt 的合成 (2) HClTyr-OEt 的合成 (3) Z-Tyr-OEt的合成 (4)以-胰凝乳蛋白酶合成 Z-Tyr-Gly-Gly-OEt 4.问题总结(实验讨论) 5.产率计算,2,catalogue,CATALOGUE,Gly-Gly 在氯化亚砜作用下酯化，得到甘氨酰甘氨酸乙酯盐酸盐（HClGly-Gly-OEt）,3,experimenta
2、l principle,PRINCIPLES,酪氨酸在氯化亚砜作用下酯化，得到酪氨酸乙酯盐酸盐（HClTyr-OEt）；而后酪氨酸乙酯与苄氧羰酰氯（Z-Cl）在碱性条件下反应，得到苄氧羰酰酪氨酸乙酯（Z-Tyr-OEt）,4,experimental principle,PRINCIPLES,Z-Tyr-OEt 与 Gly-Gly-OEt 在二氯甲烷中以-胰凝乳蛋白酶催化得到亮-脑啡肽的前三肽，即N-保护的苄氧羰酰酪氨酰甘氨酰甘氨酸乙酯（Z-Tyr-Gly-Gly-OEt）。,5,experimental principle,PRINCIPLES,6,Experimental chemical
3、s,CHEMICALS,7,Experimental chemicals,CHEMICALS,程序,取 8 mL 无水乙醇，用冰盐浴冷至 -10 ，缓慢滴入 2 mL 氯化亚砜，加完后继续搅拌20 min。 加入 Gly-Gly 1.0 g，室温搅拌 3天。 用旋转蒸发仪减压除去溶剂得到大量固体,experimental procedure,HClGly-Gly-OEt 的合成,8,9,程序,取 8 mL 无水乙醇，用冰盐浴冷至 -10 ， 缓慢滴入 2 mL 氯化亚砜，加完后继续搅拌 20 min。 加入 Tyr 1.0 g，室温搅拌 3天,experimental procedure,现象
4、,氯化亚砜在受热和有水的条件下易分解。实验过程中产生有刺激性气味的气体。塞子差点被气体冲开。 生成透明液体。 生成淡黄色透明液体，非均相体系,HClTyr-OEt 的合成,经验,要不时放气以免塞子被气体冲出造成危险(Q 关于氯化亚砜的讨论),10,experimental procedure,HClTyr-OEt 的合成,程序,现象,用旋转蒸发仪减压除去溶剂得到大量固体，用乙醇乙醚重结晶后得产物,贴士,乙醇加5毫升以内,然后加热溶解,否则之后需要加大量乙醚才能够将产物析出 (Q 关于重结晶的讨 论Q 关于旋蒸的讨论 ),结晶时加了10毫升乙醇（加多了），然后加了50毫升乙醚才重新析出。析出大量
5、白色沉淀。 风干一周后称量得到1克白色粉装固体,经验,experimental procedure,Z-Tyr-OEt的合成,程序,现象,将 HClTyrOEt0.81 g悬浮于16 mL EtOAc中，加了16.3mlEtOAc，得到油状液体。加入KHCO3 2.0 g的 13 mL 水溶液，冰浴下快速搅拌 15 min 内滴加 Z-Cl 的苯甲醇溶液0.7 mL (5.7 mmol/mL)。加完后搅拌20 min， 撤去冰浴，室温再搅拌 2-3 h。,经验,(Q 碳酸氢钾的作用),无明显变化,11,experimental procedure,Z-Tyr-OEt的合成,程序,现象,反应结束
6、后用 4 mol/L 的盐酸酸化，使水相 pH为1，分出有机相，用水、饱和的食盐水洗涤，硫酸镁干燥， 减压蒸除溶剂后，余淡黄色油状物，置于冰箱中，缓慢结晶，过滤得第一批晶体， 母液中加入石油醚 再结晶得第二批晶体,经验,如果pH未到1，可用水多洗几次 如果晶体很难析出，可以加一点小晶种影响结晶,下层为水层，上层为浅黄色 旋蒸后的黄色油状液体，很难析出 第一次就加入了石油醚，冷却才析出晶体。 0.51克白色晶体。,12,experimental procedure,以-胰凝乳蛋白酶合成 Z-Tyr-Gly-Gly-OEt,程序,现象,取 Z-Tyr-OEt270 mg (0.8 mmol)与HC
7、lGly-Gly-OEt160mg (0.8 mmol) 悬浮于 4 mL二氯甲烷中， 加入三乙胺224uL (2.0 mmol) 并在震荡混合器上震荡使底物完全溶解，此时体系的表观pH值约为10，反应液为一透明溶液,note,一定要先适当润湿试纸再测pH（Q为什么需用水润湿试纸呢？什么情况下试纸需要润湿后再测pH？Q为什么需要调节pH为10）,调节pH时，开始未润湿试纸故颜色一直不准确，当润湿过后，试纸颜色紫蓝色，已超过10.,经验,13,experimental procedure,以-胰凝乳蛋白酶合成 Z-Tyr-Gly-Gly-OEt,程序,现象,加入-胰凝乳蛋白酶8 mg和32uL水
8、 (0.4% V/V) 室温下搅拌反应 1-2 天后，反应液中有白色沉淀产生。,note,酶不能加过多. (Q水的作用?),得白色浑浊液体.,经验,14,experimental procedure,以-胰凝乳蛋白酶合成 Z-Tyr-Gly-Gly-OEt,程序,现象,反应 3 天后，将反应液过滤， 滤饼依次用二氯甲烷,1 mol/L 盐酸、去离子水洗涤。用丙酮重结晶。,贴士,得白色浑浊液体，抽滤时产物大量消耗，最后只得0.13克产物。,因为产物溶解于于二氯甲烷,故洗涤时一定要小心. 第二步用丙酮结晶时一定要耐心保证产物全部溶解与丙酮中再开始抽滤,并且由于前一步用了加热方法使产物溶解,抽滤时尽
9、量迅速.我就是由于溶解时没完全,抽滤时用错了烧瓶于是抽滤了两遍,导致大量产物堆积于漏斗管,使产率偏低,15,Questions,问题总结,Q1关于氯化亚砜的讨论 Q2关于重结晶的讨论 Q3andQ4常用分离除杂方法 Q5关于旋蒸的讨论 Q6碳酸氢钾的作用 Q7为什么酶的量不能加过量? Q8加入32ul水的作用? Q9为什么需用水润湿试纸呢？什么情况下试纸需要润湿后再测pH？ Q10为什么需要调节pH为10？,16,discussions,问题总结,17,Q1氯化亚砜的作用 遇水遇热易分解：SOCl2+2H2O=H20+SO2+2HCl 在HClGly-GLy-OEt、HClTyr-OEt合成中
10、的作用： 作为氯化剂； 使成酯反应更易进行，与一般酯化不同的是，在氯化亚砜的作用下，酯基中的两个氧原子都来自于羧基。,discussions,问题总结,18,Q2关于重结晶的讨论 原理： 利用混合物中各组分在某种溶剂中溶解度不同或在同一溶剂中不同温度时的溶解度不同而使它们相互分离。 步骤： （1）选择适宜溶剂，制成热的饱和溶液。 （2）热过滤，除去不溶性杂质（包括脱色）。 （3）冷却结晶、抽滤，除去母液。 （4）洗涤干燥，除去附着母液和溶剂。,discussions,问题总结,19,经常采用以下试验的方法选择合适的溶剂： 取0.1g目标物质于一小试管中，滴加约1mL溶剂，加热至沸。若完全溶解，
11、且冷却后能析出大量晶体，这种溶剂一般认为可以使用。 如样品在冷时或热时，都能溶于1mL溶剂中，则这种溶剂不可以使用。 若样品不溶于1mL沸腾溶剂中，再分批加入溶剂，每次加入0.5mL，并加热至沸。总共用3mL热溶剂，而样品仍未溶解，这种溶剂也不可以使用。 若样品溶于3mL以内的热溶剂中，冷却后仍无结晶析出，这种溶剂也不可以使用。,discussions,问题总结,20,混合溶剂： 先用良溶剂在较高一些的温度溶解，必要的话可热过滤除去不溶杂质，溶液慢慢加入不良溶剂，至刚刚开始出现少量浑浊且不消失，此时再加少量良溶剂使沉淀刚刚好完全溶解，停止加热和搅拌，让溶液慢慢冷却到室温结晶，必要的话可以放入冰
12、箱，过滤出晶体，并用少量预冷的混合溶剂洗涤晶体，干燥称重。,discussions,问题总结,21,Q3常用分离提纯方法 1.结晶和重结晶：利用物质在溶液中溶解度随温度变化较大，如NaCl，KNO3。 2.蒸馏冷却法：在沸点上差值大。乙醇中(水)：加入新制的CaO吸收大部分水再蒸馏。 3.过滤法 4.升华法：其中一种固体容易发生升华现象而另一种不,如固体碘和另一种固体混合物 5.萃取法：利用化合物在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同 6.溶解法：Fe粉(Al粉)：溶解在过量的NaOH溶液里过滤分离。 7.增加法：把杂质转化成所需要的物质：CO2(CO)：通过热的CuO；CO2
13、(SO2)：通过NaHCO3溶液。 8.吸收法：除去混合气体中的气体杂质，气体杂质必须被药品吸收：N2(O2)：将混合气体通过铜网吸收O2。 9.转化法：两种物质难以直接分离，加药品变得容易分离，然后再还原回去：Al(OH)3，Fe(OH)3：先加NaOH溶液把Al(OH)3溶解，过滤，除去Fe(OH)3，再加酸让NaAlO2转化成A1(OH)3。,discussions,问题总结,22,Q4常用除杂方法 1.杂质转化法 2.吸收洗涤法 3.沉淀过滤法。 4.加热升华法 5.溶剂萃取法 6.溶液结晶法 7.分馏蒸馏法 8.分液法:欲将密度不同且又互不相溶的液体混合物分离，可采用此法，如将苯和水
14、分离。 9.渗析法:一种以浓度差为推动力的膜分离操作 欲除去胶体中的离子，可采用此法。 如除去氢氧化铁胶体中的氯离子。 10.综合法,discussions,问题总结,23,Q5旋蒸原理 旋转蒸发仪主要用于在减压条件下连续蒸馏大量易挥发性溶剂。 尤其对萃取液的浓缩和色谱分离时的接收液的蒸馏，可以分离和纯化反应产物。旋转蒸发仪的基本原理就是减压蒸馏，也就是在减压情况下，当溶剂蒸馏时，蒸馏烧瓶在连续转动。,discussions,问题总结,24,Q6碳酸氢钾的作用 使用KHCO3调节pH至碱性，使氨基游离，而有利于亲核反应的进行。使苄氧羰酰氯与Tyr-OEt反应，生成Z-Tyr-OEt从而保护氨基
15、； 为什么不能用KOH调节pH? 因为制取Z-TyrOEt的反应为亲核取代反应,反应中生成2分子的HCl，实验中采用KHCO3，形成碱性环境，吸收HCl，使整个反应向右移动，增大产率；此反应在碱性环境中进行，也是为使-NH2能稳定存在，但不能采用Na2CO3或KOH，因为其碱性太强，酯类易水解。,discussions,问题总结,25,Q8加入32ul水的作用? 微量的水对酶在有机介质中的活性影响很大。酶在完全干燥的溶剂体系里基本上是不显催化能力的,但如果水加过量会导致酶活性的降低。,Q7为什么酶的量不能加过量? 开始增加酶的量，反应速率会加快，当到达一定浓度过后，速率就决定于底物的浓度而不是
16、酶的浓度了。再增加酶的量，还有可能会抑制反应进行。,discussions,问题总结,26,Q9为什么需用水润湿试纸呢？什么情况下试纸需要润湿后再测pH？ pH试纸测试的是溶液中的氢离子浓度，加水是为了促进有机溶液电离，更方便测pH。 除了这种情况，测量酸碱气体时也需要润湿试纸，也是为了让氢离子电离出来。,discussions,问题总结,27,Q10为什么需要调节pH为10？ -胰凝乳蛋白酶在pH= 10. 0 的缓冲液中的稳定性最高,在pH = 5. 0 的缓冲液中其次,在pH = 7. 0 的缓冲液中最低。,Yield calculation,产率计算,W1=1/1.356*100%=73.8% W2=0.51/1.026*100%=49.7% W3=0.13/0.4*100%=32.5%,THANKS FOR LISTENING,
