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1、免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原一抗二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素生物素过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素过氧化物酶（SP）法。PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体
2、，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物
3、使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制组织学与胚胎学）图2. SP法原理示意图SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。SP法简化了操作步骤，同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥化染色技术。2、 实验准备：1. 标本准备石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理冰冻组织切片
4、：由病理室常规处理细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h。2. 试剂准备抗体选择单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体的缺点，但是可能出现非特异性杂交。因此，不论选择单克隆还是多克隆抗体，最好同时购买两个货号的抗体，购买抗体时一定要明确是能够做IHC的抗体，抗体说明书上必须有IHC测试结果。如果该分子文献报道较多，可选择文献上常用的经典抗体。二抗试剂盒目前本实验室所用二抗试剂盒为Life Technologies Histostain-Plus Ki
5、t (HRP, Broad Spectrum)，货号85-9043，一抗反应性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠。DAB试剂盒目前本实验室所用为加强型DAB显色试剂盒，货号DAB-2032。其他试剂二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠、APES胶3. 抗体特异性验证所有免疫组化抗体均须Western blot验证抗体特异性，并需免疫荧光实验验证抗原定位。4. 耗材准备免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载玻片5. 溶液配制磷酸盐缓冲液（PBS）10PBS母液配制NaCl72 gNa2HPO412H2O37.3 gKH2PO44.3g加蒸馏水至1000 ml，充分混匀贮存。使用时用蒸馏水10倍稀释，调整
6、pH值至7.37.4。柠檬酸抗原修复液抗原修复使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，配方如下：称取柠檬酸10.5 g，溶于500 ml蒸馏水；称取Na2HPO412H2O 57.3g，溶于800 ml蒸馏水。分别量取358 ml柠檬酸溶液和642 ml Na2HPO4溶液，充分混匀后调整pH值至6.0，即得2母液，贮存备用。1%盐酸酒精浓盐酸与75%酒精按照1:99比例混合，充分混匀。三、免疫组化操作步骤1. 组织片脱蜡水化将组织片依次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15 min。依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸，每缸5 min。依次放入2个装有95%乙醇的玻璃缸，每缸5 min。依次放入9
7、0乙醇、85乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸2 min，取出。放入自来水、蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。2. 抗原修复将切片浸入1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，高压煮沸后继续加热2 min，然后停止加热让切片自然冷却。注意：抗原修复过度或不足，均会影响最终染色结果。切片骤冷可致脱片，必须自然冷却！3. 封闭内源性过氧化氢酶放入3% H2O2溶液的玻璃缸中，浸泡15 min。放入蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。放入PBS缓冲液的玻璃缸中，浸泡5 min。4. 抗体杂交甩去PBS余液，将组织片平辅在湿盒中，加正常山羊血清1滴20 l（试剂盒中的A液，根据组织大小调整用量），28放置20 min，甩干
8、。加稀释好的一抗1滴（2050 l，根据组织块大小进行调整），置于湿盒4过夜。置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS缓冲液，同法操作4次，甩干。加入生物素偶联的二抗2050 l（试剂盒中的B液，根据组织块大小进行调整），放置湿盒，37放置20 min。置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。5. 显色 加链亲和素-辣根过氧化物酶2050 l（试剂盒中的C液，根据组织块大小进行调整），湿盒内28放置520 min，甩干。置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。滴加新鲜配制的DAB
9、工作液100 l（以覆盖组织为宜），放置观察反应部位呈现黄褐色时（35 min），置装有自来水玻璃缸中涮洗3次；6. 复染浸入苏木精溶液中复染，放置5 min后，用自来水反复涮洗至水不变色，再用1%盐酸酒精分化12 s后，自来水冲洗后，反蓝水洗2 min。7. 脱水、透明和封片依次放入95、95乙醇溶液的玻璃缸中，每缸浸泡5 min，取出；依次放入2个无水乙醇的玻璃缸中，每缸浸泡5 min，取出。依次放入2个装有二甲苯的玻璃缸中，每缸浸泡5 min，取出。滴加适量中性树胶，封片，晾干。8. 注意事项整个染色过程中组织块要保持湿润，不能干片，否则会导致非特异性染色。组织切片边缘易干，因此抗体、封
10、闭液、显色液等试剂要充分覆盖组织块，避免干片。四、结果判定1. 阳性细胞判断DAB显色呈黄色。每批染色都要有特异性阳性和阴性对照为基础，才能对染色结果作出判断。抗原表达必须在特定部位，对于临床诊断来说，不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的着色多系内源干扰或人为因素所致，不能视为阳性。2. 抗原表达评价免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，我们常用的免疫组化评分方法如下：细胞染色强度评分：0（无染色），1（弱染色），2（中染色），3（强染色）肿瘤细胞阳性率评分：0（09%），1（10%25%），2（26%50%），3（51%75%），4（76%100%）将染色强度评分和阳性细胞率评分的乘积作为该切片评分值。
