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1、 引物设计 1 RT-PCR引物设计 2CDS引物设计 超螺旋科研群 307280677 微信号：wg1985316 RT-PCR 引物设计 方法一：直接打开 https:/pga.mgh.harvard.edu/primerbank / （图1） 图1 在search by 寻找基因的名字号 物种部分选择需要的类别（目前 只有，人和小鼠） 下面输入基因的名字，例如sox2 RT-PCR 引物设计 然后选择片段大小在80-150bp之间的序列如下： 然后去NCBI-Primer blast 一下： http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 双
2、向验证，引物好用 设计专属自己的引物 打开NCBI http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=sox2 选择物种 第二步，点击SOX2， 选择NM-003106.3，然后打开，点击FASAT:如下图 将序列复制粘贴到word，用UCSC，区分不同的外显子：打开这个网站，点击blat 输入刚才的全部复制的碱基 出现下面这样的图 很抱歉，这个只有一个外显子 很多外显子的话，一个个在word标注出 来，截取一段夸两个外显子的序列就可 以 选择一段序列，放入在线的primer 3 http:/bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ 上面两个都都可以
3、最后用NCBI-PRIMER -BLAST验证一下就可以 CDS扩增引物设计 1: 打开NCBI,选择GENE ,输入基因的名字 如SOX2 选择人的物种 选择CCDS3239.1，然后点击：讲序列放到word,把序列放到NEB CUTTER 打开第一个，放入序列：选择O CUTTER ，代表这个酶切位点可以用，选 择和载体中能够用的酶切位点 载体信息 可以用的酶切位点已经标注出来，优先选择 ECORI ,Bamh1，这两个酶比较便宜 这两个酶切位点可以用 SOX2-cds-F: 保护碱基+酶切位点+ATG开头的20个碱基 SOX2-cds-R:保护碱基+酶切位点+3段最后的20bp的反向互补碱基 保护碱基的选择根据酶切位点来的，实际上任意添加影响也不大 AA GAATTC ATGTACAACATGATGGAG SOX2-cds-F AA GGATCC 反补序列用这个软件 TCACATGTGTGAGAGGG 引物质量评价软件 ：http:/www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html 备注：真核细胞表达需要考虑要不要加帽子问题 谢谢大家
