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1、基于基于图像识别技术和人工神经网络的食品中大肠菌群的实时预测摘要一种基于图像识别技术预测食品中大肠菌群的方法已经被提出来过。为了得到接近实时的检测结果，就是用总的细菌和杆菌的数量来预测总的大肠杆菌的数量，因为提取大肠菌群的特征参数并识别和计算是十分困难的，而总的细菌和杆菌的数量可以使用图像识别技术来计算出来。一种理想的人工神经网络模型被提出用来预测总的大肠菌群的数量。几种模型被评估之后使得理想ANN模型得到发展。理想ANN模型包含两个隐藏的层，每层含有五个神经元。结果显示用它来预测的总的大肠菌群的数量与试验中通过传统的多重发酵技术吸收的总的大肠菌群的数量是有明确相关的，（相关系数 0.9716
2、 ）这种模型比其他预测模型的预测准确度更高。1简介 大肠菌群被频繁的用来作为细菌指示器。他们的出现表明外部污染。他们被定义成能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，当温度达到3537时孵化。温血动物的排泄物中富含大肠菌群。但它们也在水生环境，土壤和植被丰富的环境被发现。在大多数情况下，大肠菌群本身并不使人生病，但它们的存在被用来表明可能存在其他的致病微生物在粪便中。 当检测总大肠菌群时，传统的多管发酵技术被广泛使用，因为它的高准确度和低技术难度。然而，在实际工作中，我们发现这种方法需要太长时间去培养（48-72 h）而且准备的过程是如此的复杂使得在工厂中管理产品很困难。预防
3、风险的食品安全管理系统如HACCP要求卫生监管部门应该迅速的提供结果并且及时的采取补救行动来恢复对流程和产品的监管。最近，一种新的研究方法和改进型的研究方法来计算食品中大肠菌群和大肠埃希氏菌已经得到了发展。例如带染色体的琼脂和带荧光的肉汤，大肠埃希氏菌计数板这三种选择性培养基可以计算大肠菌群和大肠埃希氏菌，检测时间最少24小时。A和B基于准确性，一致性，便捷性，费用，劳动，敏感性，特异性和常规检测的时间的比较在计算冷冻黑虎虾的大肠菌群和大肠埃希氏菌上更加迅速。Reichart，Szakmr，Jozwiak，Felfoldi，Baranyai（2007）报道，氧化还原电位测量方法可以作为一种合适
4、的方法进行定量和定性测定细菌。在他们的研究文章中对用氧化还原电位测量方法测量大肠菌群进行了测试和验证，结果证明这种新方法的高效性和可靠性。另一个例子是ATP发光生物可以提供对总污染面积的实时估计，并且蛋白检测试剂盒可以显示实时的表面蛋白残留。然而，以前的研究已经表明，在土壤的情况下，ATP生物荧光的方法是不能检测当表面的细菌很少的时候，同时蛋白质的检测方法甚至在表面很多细菌时也不能检测细菌污染。接近实时的预测使制造商可以在生产中警惕总大肠菌群超过一定的限制。为了获得实时信息，以监督生产和判断食品在生产过程中的污染状况，开发展中一个新的快速检测方法迫在眉睫。然而，对于大肠菌群的定义，它不是医学细
5、菌学分类而是健康领域的细菌学，所以在没有背景的前提下很难找到一个共同的特点。因此，难以实现接近实时的检测。为了解决这个问题，在本文中，图像识别技学和人工神经网络模型被用于开发一个快速的检测系统可以估算食品中总大肠菌群数。该系统可以在30分钟内获得总大肠菌群数（MPN1/100克或毫升），而且预测的结果和实验结果是呈正相关（相关系数R2 =0.9716）的。这是一种快速，有效的尚未被报道的方法。在此之前的研究中，一些文献中也出现了关于人工神经网络用于细菌鉴定。Rebuffo, Schmitt, Wenning, von Stetten, and Scherer利用人工神经网络的傅立叶变换红外光谱
6、以确定单核细胞增生李斯特氏菌和李斯特菌，这只用了25h。Rebuffo-S, Schmitt, 和Scherer用单核细胞增生李斯特菌的人工神经网络的子网来另外定义血清型和血清型的分组。两种分类系统的整合提供了通过简单地测量一个纯的红外光谱李斯特菌这个单一的步骤就同时识别李斯特氏菌在种的水平，单核细胞增生李斯特氏菌的血清组水平，和大部分单核细胞增生李斯特氏菌菌株在血清变种水平。 Palanichamy Jayas，和lolley使用神经网络预测工厂生产线上干发酵香肠残渣中E.coiO157：H7。此外，一个大型数据库的人工神经网络（ANN）的方案已被用于分类和识别的海洋细菌属和种。大肠菌群源于
7、土壤，植物，人类和动物残渣。正如大肠菌群的定义那样，它们都是棒状生物体。因此，总的大肠菌群的数量是杆菌总数的一部分。此外，总的杆菌的数量是总细菌数量的一部分。如果食物被大肠菌群污染，杆菌总数和细菌总数必然增加，同时总杆菌数量和细菌总数的比例也将增加。因此，受污染的样品中的比例将是高于未经污染的样品中的比例，比例越高，总大肠菌群的数量就越多。我们称未受污染样本中的比例为标准比值。不同种类的食品样品，这个比值会有所不同。基于这个理论分析，食品中的细菌主要来自在食品加工过程中的原料和外部环境的污染。而且，在最后的分析中，食品中的细菌来自空气，水和土壤中的微生物。正如我们所知的，一个地区的细菌分布情况
8、是平衡的，所以总杆菌和细菌总数比值会在小范围内波动，所以总大肠菌群数的总数与杆菌和细菌之间有可能有一定的相关性。总括来说，是否可以找到总大肠菌群数量与细菌和杆菌的总数之间的关系是关键问题。在本文中，上述的想法是通过大量的实验数据证明。若干预测模型被提出来，最后提出了最佳的预测食品中大肠菌群数量的人工神经网络模型。2.材料和方法2.1材料的选择和处理2.1.1材料所有的样品都是当地食品厂的产品。面包，饼干及蛋糕被选定进行检测，以讨论总大肠菌群快速检测方法的可行性。2.1.2材料处理向50克样品加入50毫升无菌生理盐水，将他们足倒入搅拌器搅拌均匀。通过一个10微米孔径的膜滤器过滤该混合物，以去除杂
9、质颗粒。细菌是在滤液中的，因为大多数细菌的实际尺寸是0.5-5微米。振荡滤液，得到了0.1毫升滤液用来快速检测系统计算。亚甲基蓝染色方法被用于区分的活菌和死菌。亚甲基蓝被广泛用于在分析化学中作为氧化还原指示剂。在氧化环境中这种物质是蓝色的，但是，如果暴露在还原剂中会变成无色。它也可以作为一个指标，以确定一个细胞如细菌是活的或死的。蓝色指示剂在活性酶系中变为无色在，从而表明细胞是活的。亚甲基蓝上色溶液按照下面的公式来准备：亚甲基蓝色0.025克+氯化钠0.9克+氯化钾0.042克+的CaCl6H0.048克+的NaHCO0.02克+葡萄糖1克+蒸馏水100毫升苯基蓝染色溶液的制备。亚甲基蓝染色溶
10、液（0.1毫升）加入到上述滤液中（1:1）。染色时间为2分钟。为了保持细菌活着，染色之后才是涂抹玻片和固定步骤。这里使用的是与普通的固定方法（热固定方法）不同的固定方法。采用晾干固定的方法来保持细菌存活。染色后，在内部的深蓝色的圆圈中活的细菌是无色的，死菌是淡蓝色的。2.2多管发酵法三管MPN法大肠菌群发酵在FDA中被拿出来详细说明了。一个25g的样本被拿去立即与225ml的磷酸盐缓冲液或者消过毒的生理盐水按1:10的比例稀释，PH值为7.2，装在一个质的袋子里放进搅拌机中摇匀1分钟。然后这个样本被连续稀释十倍用来作为三管MPN法大肠菌群发酵法的培养液。悬浮液：从每个试管中取出1ml转移月桂醇
11、硫酸酯蛋白胨肉汤培养基中，在35下保温2448小时。培养液：从试管取一个铂环量的培养液在35的条件下与空气接触48小时，然后转移到亮绿乳糖肉汤培养基中，在35的条件下培养24-48小时。试管中与空气接触的接种体在亮绿乳糖肉汤培养基中会显示大肠菌群的存在，每1g样本中大肠菌的数量可以从MPN表中被计算出来。2.3图像识别技术应用 我们的自动模式识别程序有以下四个极端：首先是以前的图像分割阶段，其次一个对象提取阶段，第三，一个特征抽取阶段；第四步ANN识别阶段。开发程序的主要步骤，如图2所示。2.3.1图像分割在细菌图像处理中，从背景中分割图像是一个重要的步骤。正如图1所示，这幅图中细菌和背景还有
12、一些非细菌的颗粒的图像对比度是十分明显的阈值分割的R，G，B值的方法可以用来获得的二值化图像。几个几个阈值被用来进行了尝试。最适当的阈值应该准确分离细菌和背景，可以准确地分开的活菌与死细菌。在这时，死的细菌应该该都是固态务，而活的细菌应该是空心的。2.3.2目标提取为了节省处理时间，在接下来的步骤，一些大的杂质颗粒，噪音小点应首先被擦去。大多数细菌的实际大小是0.5-5微米。经过快速检测系统的放大后，图像中的细菌的大小应该是1.25-12.5毫米。一个像素的大小为0.264毫米，所以有必要除去黑色的过大或过小的连通区域的噪声。在删除这个连接区域之前，在二值图像的连通区域中必须首先标出来。这个连
13、通区域中小于pi*1.25*1.25平方毫米和大于pi*12.5*12.5平方毫米将被去掉。此外，实心连接区域将被删除，以消除死菌的影响。2.3.3特征参数的提取根据他们的形态特征，细菌可以分为三大类：球菌的细菌，杆菌的细菌，和单核的细菌。 7个特征参数要被提取，这分别是“面积，周长，圆度，最小外接矩形（MER）的长度，最小外接矩形（MER）的宽度，长度与宽度的比例，和矩形的度。为了准确地计算的圆形，活菌的中空必须首先被填充。2.3.4人工神经网络识别 反向算法被用来ANN模型的计算。以上7个特征参数被考虑用来作为输入变量来用于ANN的计算，为了加速网络的计算速度，在使用MATLAB子程序时输
14、入和输出数据在0.05-0.95范围内是正常的。作为一个正常的结果，在研究过程中所有变量都具有相同的重要性。输入和输出之间的关系可以用下面的式子表示。其中Xmin和Xmax代表这一行数据的最小和最大值。输出层包含了三个神经元，球状细菌的指示信号是一个，杆状细菌的指示信号时两个，单核细菌的指示信号时三个。这里只有一个影藏层，它包含30个神经元。Log和s型传递函数分别用于输入和输出层。直到计算的网络误差小于0.0001，传输速率为0.01，最大计算量为1000。2.4硬件系统和软件系统的设计一种计算机控制的光学显微镜系统已经被开发出来了，它能够对透明的微小对象产生连续的光学显微图像。该成像系统包
15、括光学显微镜，带有2D运转的计算机控制平台， CCD彩色数码相机，微控制单元，两个驱动单位的二进制电机。这个步进制电机被安装在显微镜的实物平台上。一台个人电脑和一套能够适用Windows的自行开发软件也是被需要的。检测系统操作软件的设计是由C +语言实现的。这种快速的自动检测系统的组织和设计示于图2。计算机发出指令来驱动对象平台。对象平台的移动是受单片机的程序控制。此外，键盘用于驱动阶段，并找到的检测区域。因为它的操作简单，我们的实验效果得到了明显的提高进入软件和填充一些检测到的信息后，系统可以自动获取和保存图片，处理和分析图像，并列计算细菌总数和总杆菌数。软件程序和硬件的开发，如示于图2。3
16、数据分析3.1人工神经网络分析神经网络是一类新的信息处理技术。神经网络的最基本组成部分是模仿人类大脑结构类似人类信息处理系统的人工神经系统或网络工程获取，存储和利用信息。它已经被广泛用来解决各种各样的问题。最常见的是利用神经网络预测什么最有可能发生。它有独特的能力去在输入和输出事件之前认识它们之间的关系。3.11构造神经网络 人们已经认识到这个网络的预测能力和执行力上应该在遵守构造数据集合的规模，隐藏层的数目，隐藏层中处理原件的数目学习规则的类型传递函数的基础上被优化，反向传播算法被用来构造ANN模型。Log函数和线性传递函数被分别用于输入和输出层。为了避免在采用反向传播算法的时候出现的过度拟合或记忆的潜在问题，选择保存最好的配置选项在这个网络最好结果被保存的地方。输入层包括两个神经元，其中对应于细菌和杆菌的总数，这是通过以下方式获得的快速检测系统。这个输出层有一个神经元来代表总的大肠菌群的
