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1、 甘油的检测方法汇总甘油的检测方法汇总 在发酵行业中，甘油作为底物，是发酵液中生物合成的直接前体，会影响外源蛋白的启动 表达效率，其含量的高低直接影响产物的发酵单位，是决定菌种取舍的重要指标，是提高工程 菌的发酵密度，提高产品生产率的关键。在生物柴油生产中，它是副产物，其含量直接影响生 物柴油的使用性能，是衡量生物柴油产品品质的重要指标之一。此外，甘油能与水结合以防止 红细胞的冷冻损伤，能延长红细胞的保存期，被普遍用作细胞内冷冻保护剂等。由于甘油用途 很广，因此其含量的测定具有非常重要的意义。 目前国内外甘油含量的测定方法较多，主要有高碘酸氧化法、Cu2 + 络合比色法、酶比色法 法、紫外-可
2、见分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法、近红外光谱法以及原子吸收法等。 下面将对其进行简要概述： 一、高碘酸法一、高碘酸法 1.原理 ：1.原理 ： 高碘酸氧化法是目前常见用于甘油含量检测的方法，利用高碘酸与甘油发生氧化还原 反应，剩余高碘酸及反应生成的碘酸与碘化钾反应生成碘，再用硫代硫酸钠进行滴定，根据消 耗的硫代硫酸钠的量来计算甘油的含量。 2.操作步骤2.操作步骤 准确发酵液 10ml 于 100mL 小烧杯中，加少量水溶解，然后转移至 100mL 容量瓶中，用水稀释 至标线， 摇匀， 静置。 用移液管准确移取 10mL 上述溶液于碘量瓶中， 加入 20mL 高碘酸钠溶液， 混合均匀后
3、，于黑暗中避光静置 40min，然后加入碘化钾溶液和 20%盐酸溶液各 15mL，调节 pH 值在 0.81.0 之间，然后用硫代硫酸钠标准溶液滴定，近终点时，加入 2mL 淀粉指示剂溶液， 继续滴定至溶液蓝色消失。同时做试样空白。 3.计算3.计算：100 1000450/10 w 12 MCVV）（ 式中：w样品中甘油的含量，； V1空白试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL； V2试样消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL； C硫代硫酸钠标准溶液的浓度，molL；M甘油相对分子质量； 二、酶比色法二、酶比色法 1.原理1.原理： 它是利用酶的特异性催化反应建立的测定甘油的一种酶学方法，是指甘
4、油在甘油激酶 作用下转化为 3-磷酸甘油，后者由磷酸甘油氧化酶催化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢，然后 过氧化氢和 4-氨基安普比林、4-氯酚在过氧化物酶催化下反应生成紫兰色、能在 500 nm 左右 有特征吸收峰的醌亚胺，通过颜色深浅即吸光度的变化测定所生成的 H2O2，甘油的含量与生成 的 H2O2成正比，这样用比色法就可以测定甘油的含量。 2.操作步骤2.操作步骤 波长：500nm (480520nm) 反映温度：37 比色杯光径：1cm 取一定量 R1(参看 R2 瓶签)加入 1 瓶 R2 中，溶解后即为工作液，工作液预先保温至测试温度。 空白管校准管样品管 工作液1ml1ml1ml 蒸馏
5、水0.0100 标准品0.01 样品000.01 分别混合均匀，在反应温度保温 10 分钟，以试剂空白管校零，记录校准及样品 OD 值。 3.计算3.计算： 甘油浓度=A样品/A校准校准浓度（mmol/L 或 mg/dl） 三、高效液相色谱法三、高效液相色谱法 1. 原理原理：高效液相色谱法( HPLC) 的原理是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同 极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，利用色谱 柱对待测混合物先进行分离，然后再进行检测，从而实现对试样的分析，因而其测量的准确性 和精确度较高，目前已成为检测生化分子较常用的一种方法。 2. 操作步骤
6、2. 操作步骤 （1）首先用水将发酵液稀释 2.5 倍,然后加 H3PO4调 pH 至 5.5,在转速 8000r/min、温度 4下 离心 10min,经微孔滤膜过滤用于 HPLC 分析； （2）将甘油标准系列溶液在最佳色谱条件下进行 HPLC 分析,以峰面积外标法定量得到甘油标 准曲线； （3）按照样品预处理方法处理后进样 5 微升,记录峰面积,代入线性方程中,计算其测定值。将 计算值乘以稀释倍数后,即得发酵液中甘油的含量。 四、气相色谱法四、气相色谱法 1.原理.原理： 气相色谱分析法是用于分离分析复杂样品中的化合物的一种方法，其原理是一定量的 气体或液体分析物被注入到柱一端的进样口中，
7、在载气带动下通过色谱柱，分析物的分子会受 到柱壁或柱中填料的吸附。由于不同的样品具有不同的物理和化学性质，与特定的固定相有着 不同的相互作用，使得每一种类型的分子都有自己的通过速率，因此，分析物中的各种不同组 分就会在不同的时间到达柱的末端，从而得到分离。当化合物从柱的末端流出时，它们被检测 器检测到，产生相应的信号，并被转化为电信号输出，从而确定每一个组分到达色谱柱末端的 时间顺序以及每一个组分的含量。 2.操作步骤2.操作步骤 （1） 标准溶液的配制 在 7 个 25mL 容量瓶中分别准确称入 0、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5g 甘油（精确至 0.1mg），
8、再分别移入 2mL 内标贮备液，用混合溶剂定容并摇匀，作为标准 工作溶液。其中甘油质量浓度分别为 0、2、4、8、12、20g/L，内标质量浓度均为 8g/L。 （2）样品的制备 在 25mL 容量瓶中加入 5ml 的发酵液样品，移入 2mL 内标贮备液，用混合溶 剂定容至刻度并摇匀。 （3）GC 条件 色谱柱：HP-5 石英毛细管柱，30m（柱长）0.32mm（内径）0.25m（膜厚）。柱温：初 始温度 120， 保留 5min， 以 20/min 升至 290， 保留 10min。 进样口温度 ： 280， 进样量 ： 0. 2 L，分流比 ： 1001。检测器（FID）温度 ： 300，
9、氢气流速 ： 40mL/min，空气流速 ： 300mL/min。 载气：氮气，流速：1mL/min，恒流模式 （4）进样，计算4）进样，计算 五、酶电极法五、酶电极法 1、检测原理、检测原理 利用生物酶只能催化一种或一类底物的性质，将甘油氧化酶进行固定化处理，样本中的甘油在 甘油酶膜的作用下被催化生成过氧化氢， 根据电化学的原理， 过氧化氢的浓度与电压值正相关， 根据标准液、缓冲液的电压值响应值来确定样本中甘油浓度。 甘油浓度与电压值相关性分析 2.操作步骤操作步骤 按相关操作说明进行。整个检测过程不超过 45 秒 应用范围：发酵过程甘油浓度检测，食品中甘油检测， 西尔曼科技有限公司国内唯一
10、一家有能力生产可以不用 预稀释样本就可以检测高达1甘油浓度的分析的制造商。 应用范围：发酵过程甘油浓度检测，食品中甘油检测， 西尔曼科技有限公司国内唯一一家有能力生产可以不用 预稀释样本就可以检测高达1甘油浓度的分析的制造商。 六、总结六、总结 甘油的测定方法很多,最常用的是化学法。化学法测定甘油含量费用较低,但操作繁琐,试剂 用量大,耗时长,且有时误差极大。 酶法测定甘油专一性强,只与溶液中的甘油特异性地反应,但所 需试剂昂贵,不利于工业应用和大量样品的检测。测定游离甘油最灵敏的方法是气相色谱法、 液相色谱法，精确度较高，但需对甘油进行硅烷化，操作麻烦，成本也较高。 由于高碘量法受发酵液中的杂质（糖类、多元醇）影响大，特别是发酵中甘油含量低时， 单用此方法检测基本不准确；高效液相色谱法检测准确，但发酵样品前处理工作量大，不适合 产生大量样品的。因此使用酶电极法测定发酵液中甘油含量，具有速度快、专一性强，由于固 定化酶可以重复利用，单次检测相对于酶比色法具有更低的成本。
