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1、重组DNA技术,11.1 重组DNA技术是基因工程的核心技术 11.2 获得需要的目的基因（外源基因） 11.3 构建重组质粒和基因克隆 11.4 转化受体细胞和转化子的筛选 11.5 转化子的分析Southern杂交,重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。 所谓基因工程(genetic engineering)就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。,11.1 重组DNA技术是
2、基因工程的核心技术,重组DNA操作一般步骤：,（1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子； （3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。,获得需要的目的基因常用的方法： （1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(gene library)，从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。,11.2 获得需要的目的基因（外源基因）,细胞
3、内总DNA的提取分离与基因文库的构建,细胞内总DNA的提取分离程序,紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。,基因文库的构建 将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。,反转录人工合成互补DNA,构建基因文库获取目的基因存在的问题 费时费事 内含子序列,反转录人工合成互补DNA方法的优势 获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因,聚合酶链式反应（PCR）,PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。,加入4种物质： （1）作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链 各自5端序列相互补的DNA引物（2
4、0个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。,聚合酶链式反应（PCR）,变性、退火、延伸三步曲,变性：双链DNA解链成为单链DNA 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,聚合酶链式反应（PCR）,每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍,30轮循环可获得 230（1.07109)个基因片段,PCR技术的发明,PCR的发明是DNA操作技术的革命 美国Mullis教授 开汽车时的联想,逶迤崎岖的山路DNA双螺旋 行驶的汽车一小段DNA引物 1988年发明
5、了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖,基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、载体和宿主菌。 微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。,11.3 构建重组质粒和基因克隆,限制性内切酶,限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点分子手术刀 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。,限制性内切酶,已经发现和鉴定了200多种,EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段 粘性末端 T4连接酶,载体,载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工
6、具，目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。 质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。,1该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。 2进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复制形成大约500个拷贝。 3在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点,细菌质粒pUC18,pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG和X-gal，X-gal便会被半乳糖苷酶水解成
7、兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆,4利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒,5pUC18还携带了氨卞青霉素抗性基因，可筛选重组质粒。,以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆,将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤： 1获得目的基因和质粒载体； 2形成重组质粒； 3制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞； 4培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝； 5筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。,一般克隆基因的检查和鉴定方法,琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段： 磷酸基团带负电荷 酶解片段向阳极移动
8、电场驱动力和凝胶阻力 不同迁移率 分子量标准参照物,酶切和电泳方法,32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法,DNA杂交直接鉴定,基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。 通过DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物,11.4 转化受体细胞和转化子的筛选,构建缺失chlL基因的蓝细菌突变
9、株,遗传转化常用的方法,载体法转化农杆菌介导法 基因的直接转移 （1）高压电脉冲电激穿孔 （2）基因枪法 （3）微注射法,纪念发明者Edward Southern （1）提取总DNA （2）酶解 （3）电泳 （4）转移到滤膜 （5）变性解链 （6）DNA探针及杂交 （7）洗脱 （8）放射自显影 （9）比较分析,11.5 转化子的分析Southern杂交,Southern杂交分析示例,A. DNA体外重组实验 B. 抗生素筛选转化子细胞 C. 培养突变株细胞 D. Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中,1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boy
10、er带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。,重组DNA技术的一般操作步骤有：(1)获得目的基因；(2)构建重组质粒；(3)转化受体细胞；(4)筛选和鉴定转化子；(5)培养转化细胞获得所需性状或所需产物。 获得目的基因的方法有：提取总DNA构建基因文库并从中调用；以mRNA为模板合成互补DNA片段；利用PCR特异性扩增所需目的基因片段等。用紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。 用限制性内切酶识别并切开核酸序列特定位点，将外源基因插入到载体中，用重组载体转化宿主细胞，外源基因将随宿主的繁殖而复制，这种过程称为基因的克隆。 凝胶电泳是用于分离、纯化和鉴定DNA片段最常规的实验技术。可依据DNA分子的大小来使其分离。还可以利用DNA杂交技术直接鉴定带有重组质粒的细菌克隆。 利用载体法或基因直接转移等技术将外源目的基因转入合适的宿主细胞中进行表达，获得所需表达产物或所需性状。用Southern杂交对转基因生物外源目的基因进行检测分析。,本章摘要,
