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1、第三章 生物制品的制备P62,一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法 （1）原料选择 原料的选择原则： 有效成分含量高，新鲜； 原料来源丰富，产地较近； 原料中杂质含量少； 原料成本低等。,第一节 一般生物制品的制备方法,植物原料生长的季节性； 微生物原料的对数期； 动物原料的年龄与性别。,原料的选择注意事项：,动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。 植物原料：要择时采集并就地去除不用的部分，保鲜处理； 微生物原料：要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。,（2）原料的预处理与保存：,冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用-40速冻。 有机溶剂脱水法。常用的
2、有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。 防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。,原料的保存方法：,生物组织与细胞的破碎：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。常用的破碎方法：,二、生物制品的提取,细胞破碎,定义：细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜 目的：破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，获得有效的提取。 细胞破碎是生物大分子初级分离纯化的第一步，也是一个重要环节，它直接影响了产物的加收率及纯度,动物细胞: 多分泌到细胞外培养液 植物细胞
3、: 多为胞内产物 微生物（细菌/真菌）: 胞内、胞外 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。,不同类型的细胞分泌目标产物的类型：,大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。 有些目标产物存在于生物体中。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。,提取,细胞破碎,溶剂,溶剂层,不溶性物质,沉淀,离心,一、机械破碎方法,通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。,常用的仪器,高速组织捣碎机,匀浆器,研磨器,高速组织捣碎机,手提式匀浆器,研杆,管,匀浆器研杆及管的横载面,几百微米的间隙,台式匀
4、浆器,研磨器,物理破碎方法,通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物理破碎方法。 物理破碎方法多用于微生物细胞的破碎。,物理破碎法的分类,物理破碎法,温度差破碎法,压力差破碎法,超声波破碎法,超声波细胞破碎机,化学破碎方法,化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透过性改变。 常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。 十二烷基硫酸钠：SDS,酶学破碎方法,酶学破碎方法：利用溶解细胞壁的酶(外加的或细胞本身存在的酶)处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压、冲击等方法破坏细胞膜 分为：外加酶制剂和自溶法。,自溶作用,自溶作用是利用生物体自
5、身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。 在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。 自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。 缺点：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,（2）提取（extraction） 生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时，首先要根据活性物质的性质， 选择提取试剂。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等）。 考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。 注意提取的温度、pH、变性剂等因素。,包括蛋白质、
6、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有： 1.沉淀法：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法等。,第二节 各类生物制品的分离纯化方法一、蛋白质类制品的分离纯化方法,(2) 按分子大小分离的方法：有超滤法和透折法、凝胶层析法、超速离心法等。其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。,(3)按分子所带电荷进行分离的方法 氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它们具有等电点，在离开等电点的pH时便会带正或负电荷。例如某蛋白质等电点为7.0，当溶液pH为4.0时，分子则带有正电荷。由于具有该性质，利
7、用带电性质进行分离是极其有效的方法。利用电学性质进行分离的方法有离子交换层析、电泳法、等电点聚焦法等。,（4）亲和层析法 大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。 亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。,核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法。提取法生产DNA和RNA，先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离RNA与DNA。发酵法主要用于生产单核苷酸。,二、核酸类制品的分离纯化方法,由于各种糖类制品的性质和原料来源不同，没有统一规范的提
8、取和纯化工艺。这里只介绍多糖和粘多糖的一般分离纯化方法。,三、糖类制品的分离纯化方法,非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。 降解法适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖。如从软骨中分离提取硫酸软骨素，就是用碱处理进行降解。又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。,（1）提取方法,常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。 乙醇沉淀法：是从提取液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于分级分离。4-5倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。用季铵化合物也可沉淀粘多糖。粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基铵（CTA
9、）等。,（2）分离方法,（1）提取方法（extraction ） 脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极性脂是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合的。提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏这种结合键，将脂质溶解出来。常用的溶剂有组合溶剂，醇是其中的主要成分，此外还有氯仿、甲醇、水等。,四、脂类制品的分离纯化方法,沉淀法 ：由于不同脂质在丙酮中溶解度不同，故常用它进行沉淀。 吸附层析法：常用吸附剂有硅胶、氧化铝等。它是通过极性和离子力等把各种化合物结合到固体吸附剂上。洗脱一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非极性的先流出，极性的后流出。,（2）纯化方法,离子交换层析法: 脂质分子的存在有非解离
10、、两性离子和酸式解离三种状态。根据它们在一定pH条件下的解离情况，选择适当的离子交换剂可将它们提纯。如TEAE纤维素对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。,（1）氨基酸的生产方法 蛋白质水解法：水解法有酸水解、碱水解和酶水解三种。,五、氨基酸类制品的分离纯化方法,用盐酸水解为常用方法，其优点是水解迅速、完全，产物全部是L型氨基酸，缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部分被破坏。 碱水解法易产生消旋作用，较少应用。 酶水解法水解不够完全。,发酵法： 菌株经过发酵后，从培养液中提纯氨基酸。 化学合成与酶促合成法 化学合成法一般得到的是DL型氨基酸，尚需要对异构体拆分；酶促合成法也是酶工程在医药工业上的应用，
11、优点是技术工艺简单，转化率高，副产物少和易提纯等。,有沉淀法、吸附法和离子交换法。 沉淀法：根据形成沉淀的原理不同分为两种：是依据不同氨基酸在水中或其他溶剂中的溶解度差异进行沉淀分离。是用特殊试剂沉淀某种氨基酸，如用邻二甲苯-4-磺酸与亮氨酸形成不溶性盐沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸游离出来。,（2）氨基酸的分离方法,吸附法：这是利用吸附剂根据氨基酸吸附力的差异进行氨基酸分离的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分离就是利用活性炭对其吸附的原理。 离子交换法：氨基酸是两性电解质，在一定pH条件下，不同氨基酸带电性质及解离状态是不相同的，因此在离子交换剂上被吸附的强度不同。常用的离子交换剂为强酸型阳离
12、子交换树脂，洗脱主要用pH梯度洗脱。,基因工程产物的特点： 产物大多数处于细胞内，需进行细胞破碎 产物浓度较低，杂质多，提纯困难 产物多是大分子蛋白质，通常不稳定，易失活,第三节 基因工程制品的分离纯化方法,1、含目的产物的起始物料的特点 各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。 这些因素包括： 菌种类型及其代谢特性。包括菌种的各种生物学性质，产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达方式，代谢物种类，产物类似物、毒物和能降解产物的酶类等；,一、影响分离纯化工艺设计的主要因素,原材料和培养基的来源及其质量； 生产工艺和条件。包括灭菌方法和条件，生产方式（连续、批式、半连续），生产周期，生
13、产能力，工艺控制条件、因素及方式等； 初始物料的物理、化学和生物学特性。包括产物浓度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、粘度、流体力学性质和热力学性质等。,2、物料中杂质的种类和性质 杂质种类和性质包括相关性和非相关性杂质的含量、化学性质、结构、相对分子量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。,3、目的产物特性 产物特性主要有化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。,4、产品质量的要求 产品质量标准和用
14、途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。,二、分离纯化的基本过程 分离纯化是极其重要的一环，这是由于工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高； 另外由于基因工程药物是从转化细胞、不是从正常细胞生产的，对产品的纯度要求也高于传统产品。分离纯化要比传统产品困难得多。,分离纯化一般不应超过45个步骤，包括细胞破碎 、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。,一般制品分离纯化的一般流程,1、根据产物表达形式来选择 分泌型表达产物的发酵液的体积很大、但浓度较低
15、，必须在纯化前进行浓缩，可用沉淀和超滤的方法浓缩。,二、选择分离纯化方法的依据 P80,产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达之间的一种形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于分离纯化。 为了获得周质蛋白，E.coli经低浓度溶菌酶处理后，可采用渗透压裂解的方法来获得，能够回收到高质量的产物。,E.coli细胞内可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法。如果没有可以利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基，一般先用离子交换色谱，处于极端等电点的蛋白质用离子交换分离能去掉大部分的杂质。,应选择不同机制的分离单元来组成一套分离纯化工艺，尽早采用高效的分
16、离手段，先将含量最多的杂质分离去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。,2、根据分离单元之间的衔接选择,即通常： 先选用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀、超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白类杂质）； 随后采用高分辨率的操作单元（如具有高选择性的离子交换色谱和亲和色谱）； 凝胶排阻色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后。,色谱分离次序的选择同样重要 色谱次序能够提高分离效率，当几种方法连用时，最好以不同的分离机制为基础，经前一种方法处理的样品应能适合于作为后一种方法的料液，不必经过脱盐、浓缩等处理。 如经盐析后得到的样品，不适宜于离子交换层析，但对疏水层析则可直接应用。,离子交换、疏水
