第2章 基本原理.ppt

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1、第二章 植物组织培养基本原理,植物组织培养,第 二 章,第一节 细胞全能性,第二节 器官发生,第三节 体细胞胚胎发生,第一节细胞全能性,一、细胞全能性概述,植物体的每一个细胞都含有一个完整个体的全套基因，这些基因在适宜的外界条件下按照某种特定的程序先后表达，最终分化形成一个完整的植株，称为细胞全能性（totipotency) 细胞全能性的相对性 不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的反应；,细胞全能性 Totipotentiality,植物细胞全能性 一个植物细胞所具有的产生完整植物个体的潜在能力。,克隆羊的诞生过程 从芬兰多塞特母绵羊的乳 腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养

2、液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞； 从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞； 利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞； 将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。,植物细胞按照分裂能力分三类,在细胞周期中运转的细胞，属周期细胞 暂时脱离细胞周期的细胞，它们可在适当的刺激下重新进入细胞周期，进行增殖。属G0期细胞。

3、不可逆地脱离了细胞周期，失去分裂能力，保持生理机能的细胞，为终端化细胞.,第一节细胞全能性,第一节细胞全能性,一个植物细胞向分生状态恢复的程度，取决于它在自然部位上所处的位置和生理状态。,第一节细胞全能性,细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的,细胞全能性,脱分化,细胞分裂,再分化,个体再生,第一节细胞全能性,二、细胞脱分化,在一定的培养条件下，一个成熟细胞转变为分生状态并形成未分化的愈伤的现象，称为脱分化（dedifferentiation) 细胞脱分化并非离体培养所特有，而是植物界普遍存在的现象。 离体外植体细胞实现全能性，首先经历脱分化使其恢复分生状态，然后进行再分化。 脱分化是

4、分化的逆过程。,Tissue; organ,dedifferentiation,？,实现细胞全能性的方法有： 1、以植物体细胞为材料，可以获得二倍体植株 可以开花国、结果。 2、以植物性细胞如大小孢子体为材料，可以 获得单倍体或其它倍性的植株。 3、以植物单细胞的原生质体或融合的原生质体 为材料，可以获得不同倍性的植株，甚至自然中 不存在的远缘杂种。,第一节细胞全能性,细胞脱分化与愈伤组织形成,细胞脱分化是细胞生理状态的改变，脱分化细胞经过连续的有丝分裂，形成愈伤组织。,切取 形成层,无菌接种,诱导愈伤组织 的形成,试管苗的形成,培养室,移栽,脱分化,再分化,第一节细胞全能性,愈伤组织形成的过

5、程,从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：启动期 （诱导期）、分裂期和形成期。 三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细胞的平均大小都有明显的差别。,为什么要进行愈伤组织培养,无性繁殖并大大量扩繁被培养的植物 为细胞悬浮培养盒次生代谢产物生产与利用、原生质体培养和细胞融合提供易于操作的起始材料 为植物体细胞无性系变异、细胞突变体筛选创造适宜的体系和基础 为外源基因的遗传转化提供便于保存和利用的操作对象 为种质资源的保存提供新的形式 为离体研究植物组织和细胞分裂、分化、代谢和状态的转变创造适宜的材料和体系,1. 愈伤组织的诱导,外植体的类型与生理状态：选择细胞分化水平较低或含低分化细胞的器

6、官或组织；选择幼嫩、分生能力强、不含发育抑制物或其含量较低的器官或组织作为诱导愈伤组织的外植体。,外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。,适于悬浮培养 适于再生植株,愈伤组织的诱导,培养基的选择：培养基的类型；激素含量等 其他培养条件：温度（25-28或28-30 ）、光照（光照周期12-16h；光照强度1500-2000 lx） 愈伤组织的类型： 颜色：奶黄色；白色有光泽；淡绿色；黄色或褐色,质地：,是否具有胚性：胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织,愈伤组织的诱导,愈伤组织形成特点,第一节细胞全能性,Stage 1. 诱导期（Induction）: 诱导期是细胞准备分裂的时期，是愈

7、伤组织形成起点。 特点：在诱导期，代谢活化了，细胞内蛋白质和RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。细胞内的合成代谢迅速进行，但是细胞的大小仍然和外植体时一样，没有多大改变。,受激素作用后，分裂前细胞的主要变化有:,一、呼吸作用加强，消耗氧气的量明显增加。 二、多聚核糖体的不断增加，到有丝分裂前 RNA的含量增加300 三、蛋白质合成加快，分裂前细胞内蛋白质 的总量增加200 四、各种与分裂有关的酶活性大加强。,Stage 2.分裂期（Cell division）,外植体中已分化的活细胞在外源激素的作用下，外植体外层细胞出现了分裂，由于外层细胞的迅速分裂使得这些细胞的体积缩小，逐渐回复到分生组

8、织状态，因此也称为回复变化。在回复变化时，细胞通过脱分化的启动期而进入分裂，并开始形成愈伤组织。 特征：是外层细胞进行分裂，而中间的细胞不分裂。另外细胞数目增加，体积变小；细胞核和核仁增到最大，RNA含量升高等。,第一节细胞全能性,第一节细胞全能性,Stage 3.形成期（Differentiation）,特点：外植体细胞经过诱导期和分裂期形成了无序结构的愈伤组织。进入形成期后，表层细胞分裂逐渐停止，内部深处细胞开始分裂，组织内部形成瘤状的拟分生组织。形成愈伤组织形成中心或者进一步分化成为维管组织。,愈伤组织的特征： 细胞分裂快，结构疏散， 缺少有组织的结构， 颜色浅而透明。,第一节细胞全能性

9、,第一节细胞全能性,愈伤组织状态,优良的愈伤组织： 1.具有旺盛的自我增殖能力； 2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体； 3. 高度的胚性或再分化能力； 4. 可以长期继代保存。,愈伤组织状态,第一节细胞全能性,愈伤组织状态,向日葵下胚轴的愈伤及分化芽,水稻成熟胚的愈伤,玉米幼胚的愈伤,第一节细胞全能性,类型：结构致密，生长较慢，容易分化成苗，也称保守分裂型，呈乳白色或绿色，结构致密，复杂多样,生长缓慢，不易长时间保持胚性。愈伤组织经过多次继代才获得胚胎发生-间接胚胎发生。再生频率低、周期长易分化畸形苗。,禾本科的愈伤组织类型：,愈伤组织状态,优良的愈伤组织： 1.具有旺盛的自我增殖能

10、力； 2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体； 3. 高度的胚性或再分化能力； 4. 可以长期继代保存。,第一节细胞全能性,类型：结构松软，生长旺盛，色泽鲜艳，增殖很快，也称亢进分裂型；淡黄色或黄色，结构松散呈颗粒状，生长较快，能够长时间保持胚性。在诱导培养基直接产生胚性愈伤组织和胚状体-直接胚胎发生,禾本科的愈伤组织类型：,愈伤组织状态,优良的愈伤组织： 1.具有旺盛的自我增殖能力； 2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体； 3. 高度的胚性或再分化能力； 4. 可以长期继代保存。,第一节细胞全能性,禾本科的愈伤组织类型：,淡黄色或黄色型胚性愈伤组织扫描电镜下观察圆球状胚状体。,

11、愈伤组织状态,第一节细胞全能性,禾本科的愈伤组织类型：,II型愈伤组织转入分化培养基形成绿芽点，扫描电镜观察：胚状体一端向上伸出胚芽鞘，一端向下伸出根，通过体细胞胚胎发生可形成完整植株。,愈伤组织状态,第一节细胞全能性,类型：结构疏松，生长缓慢，色泽暗淡，称为衰败型。白色或灰色透明，软散无结构继代易褐化而死亡。电镜观察，细胞排列无序，细胞结构不明显，无细胞团或球形细胞。,禾本科的愈伤组织类型：,愈伤组织状态,优良的愈伤组织： 1.具有旺盛的自我增殖能力； 2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体； 3. 高度的胚性或再分化能力； 4. 可以长期继代保存。,第一节细胞全能性,影响细胞脱分化因

12、素,1.外植体本身损伤 2.生长调节剂 3.光照 4.细胞位置 5.外植体的生理状态 6.植物种类差异 7.基因型,外植体褐变 多酚氧化酶是植物体内普遍存在的一类末端 氧化酶，它催化酚类化合物形成醌和水，醌 再经非酶促聚合形成深色物质，对植物体材 料产生毒害作用。 褐变的影响因素：1、植物种类及基因型。2、 外植体的部位及生理状态。3、外植体的受伤 程度。4培养基的成分和培养条件。5、培养时间 过长,防止褐变的方法： 1、选择适宜的外植体 2、对外植体进行处理，如先进行低温处理， 再放入只含糖的琼脂培养基中，使酚类物质 渗入到培养基中。 3、选择适宜的培养基和培养条件 4、添加褐变抑制剂和吸附

13、剂。如维生素C等 5、连续转移。减轻酚类化合物的毒害。,玻璃化现象：在进行植物组织培养时，经常会出现 试管苗生长异常，叶等出现透明或半透明的水浸状 植物矮小肿胀，失绿等现象称为玻璃化现象。原因 复杂没有定论。 防止玻璃化措施： 1、增加琼脂浓度。 2、提高糖的含量或加入渗透剂，降低培养基中渗透势，减少植物材料可获得的水分。 3、降低培养基中细胞分裂素的含量 4、增加光照、控制温度、改善通风换气条件。,愈伤组织状态,优良的愈伤组织： 1.具有旺盛的自我增殖能力； 2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体； 3. 高度的胚性或再分化能力； 4. 可以长期继代保存。,第一节细胞全能性,三、细胞再

14、分化,含义：离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株，这个过程称为再分化。 1.细胞水平的再分化 2.组织水平的再分化 3.器官水平的再分化（又称器官发生）,愈伤组织状态,优良的愈伤组织： 1.具有旺盛的自我增殖能力； 2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体； 3. 高度的胚性或再分化能力； 4. 可以长期继代保存。,第一节细胞全能性,影响细胞再分化因素,关键：维管组织的分化（生长素、蔗糖浓度、细胞分裂素和赤霉素、物理因子） 不同种类植物的再生能力差异； 再生条件没有完全掌握； 影响因子与脱分化因子基本一致。,愈伤组织

15、状态,优良的愈伤组织： 1.具有旺盛的自我增殖能力； 2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体； 3. 高度的胚性或再分化能力； 4. 可以长期继代保存。,第一节细胞全能性,再分化的两种方式,体细胞胚胎发生：双极性结构，与母体愈伤组织或外植体无维管束连接。 器官发生 （也称茎芽分化）：单极性结构，里面长出原形成层束，与原先存在于愈伤组织或外植体中的维管组织连接在一起,愈伤组织状态,优良的愈伤组织： 1.具有旺盛的自我增殖能力； 2.容易散碎，以便建立优良的悬浮系或原生质体； 3. 高度的胚性或再分化能力； 4. 可以长期继代保存。,第二节 器官发生,器官发生：在离体的培养条件下，植物的组织

16、或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。,第二节 器官发生,From root,From embryo culture,Callus arising from leaf tissue,第二节 器官发生,一、器官发生方式（3种）,1.先分化芽，再分化根； 2.先分化根，再分化芽； 3.在愈伤组织块的不同部位上分化出根和芽,第二节 器官发生,（1）先分化芽，再分化根,先分化芽，待芽伸长后在其幼茎基部长根，形成完整的小植株。这种方式在木本植物培养中比较普遍，芽和根的诱导要分两步完成。,第二节 器官发生,（2）先分化根，再分化芽,先分化根，在根上产生不定芽而形成完整植株。,百合根尖愈伤组织诱导,第二节 器官发生,（3）同时诱导根、芽,在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后二者的维管组织互相连接，成为具有统一的轴状结构的小植株。,风信子形成的芽和根,第二节 器官发生,二、器官发生的解剖学,器官发生型-外植体,两种途径,器官型-外植体本身存在器官原基（茎尖、根尖）,形成愈伤组织,器官原基及器官形成,第二