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1、沉淀分离技术,沉淀（precipitation）：在溶液中加入沉淀剂使溶质的溶解度降低，形成固相从溶液中析出，从而达到分离的一种技术。 优点：过程简单、成本低、原料易得、便于小规模生产 缺点：过滤困难、产品质量较低、需重新精制,盐析 有机溶剂沉析 等电点沉析 有机聚合物沉析 其他沉析技术,一 盐析,盐析 沉淀剂：采用盐，硫酸铵 操作范围：饱和度20- 100% 适用于：蛋白质的分离,一、盐析 原理 溶液加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表面的带相反电荷的离子基团结合，中和了生物分子表面的电荷，降低了生物分子与水分子之间的相互作用，生物分子表面水化膜逐渐被破坏，当盐浓度达到一定的限度时，生物分
2、子之间的排斥力降到很小，此时生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中析出。 产生盐析的另一个原因是大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，使生物分子脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀析出。,影响盐析的因素（p95-96） （一）盐离子浓度 在低盐浓度时，盐离子能增加生物分子表面电荷，使生物分子水合作用增强，具有促进溶解的作用，称盐溶现象。 当盐浓度达一定值后,盐浓度升高，生物分子溶解度不断降低,产生了盐析作用,不同的生物分子，“盐溶”与“盐析”的分界值不同。,（二）生物分子种类 生物分子的分子结构不同，其分子表面亲水基团与疏水基团不
3、相同，不同生物分子产生盐析现象所需中性盐的浓度（离子强度）亦不同。 （三）生物分子浓度 溶液中生物分子的浓度对盐析的效果有很大的影响，要得到理想的沉析效果，必须将生物分子的浓度控制在一定的范围内。一般对于蛋白质溶液，其浓度为2%3%比较合适。,（四） pH值 在盐析时，如果要沉析某一成分，应将溶液的pH值调整到该成分的等电点，如果希望某一成分保留在溶液中不析出，则应使溶液的pH值偏离该成分的等电点。 （五）温度 多数物质的溶解度会受温度变化的影响。,盐析的操作与应用 （一）盐析的操作 1、盐的处理 硫酸铵使用时要求纯度较高，生产时为降低成本，一般选用化学纯的硫酸铵，在使用前应进行预处理，可通过
4、化学法将重金属除去（如通入H2S后过滤），再将硫酸铵重结晶备用。 2、加盐的方法 （1）直接加入固体硫酸铵法 （2）加入饱和硫酸铵溶液法,3、盐析操作注意事项 （1）盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸铵全部加完后，应放置30min以上才可进行固-液分离。 （2）经过一次分级得到的盐析沉淀，能否进行第二次盐析要靠试验确定。 （3）盐析操作时加入盐的纯度、加量、加入方法、搅拌的速度、温度及pH等参数应严格控制。,（4）盐析时生物分子浓度要合适，应充分考虑共沉及稀释后收率、盐量和固-液分离等问题。一般低浓度硫酸铵可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下
5、来需要较高的离心速率和较长的离心时间。（5）盐析后溶液应进行脱盐，常用的办法有透析、凝胶过滤及超滤等。,（二）盐析的主要应用 盐析是最早使用的生化分离技术之一，由于易产生共沉作用，故其分辨率不是很高，但配其他手段完全能达到很好的分离效果。 由于成本低，操作安全简单，对许多生物活性物质具有很好的稳定作用，常用于蛋白质、酶、多肽、多糖、核酸等物质的分离纯化。,二、有机溶剂沉析 原理 （一）亲水性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，使溶质分子周围的水化层变薄，导致脱水而相互聚集析出，也就是降低了溶质的溶解度。 （二）有机溶剂的介电常数比水小，加入有机溶剂后，整个溶液的介电常数降低，带电的溶质分
6、子之间库仑引力增强，使溶质分子相互吸引而聚集。,影响有机溶剂沉析的因素 （一）温度 大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，一般在0以下，操作时要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂必须缓慢，并不断搅拌以免局部浓度过浓。温度越低，得到的生物活性物质越多，而且可以减少有机溶剂的挥发。,（二）生物样品的浓度 与盐析相似，样品浓度低时增加有机溶剂投入量和损耗，降低了溶质回收率，易产生稀释变性，但共沉的作用小，有利于提高分离效果。反之，对于高浓度的生物样品，节省了有机溶剂，减少了变性的危险，但共沉作
7、用大，分离效果下降。一般认为，对于蛋白质溶液0.5%2%起始浓度较合适,对于粘多糖以1%2%为起始浓度为宜。,（三）pH 有机溶剂沉析时适宜的pH，要选择在样品稳定的pH范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH，通常是选在等电点附近，以提高该沉析的分辨能力。但应注意的是有少数生物分子在等电点附近不稳定，影响其活性；同时尽量避免目的物与杂质带相反电荷而加剧共沉现象的发生。,（四）离子强度 在有机溶剂和水的混合液中，当离子强度很小，物质不能沉析时，补加少量电解质即可解决。盐的浓度太大(0.10.2molL以上)，就需大量的有机溶剂来沉析，并可能使部分盐在加入有机溶剂后析出。同时盐的离子强度达一定
8、程度时，还会增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度。所以一般离子强度在0.05或稍低为好，既能使沉析迅速形成，又能对蛋白质或酶起一定的保护作用，防止变性。,（五）金属离子 在用有机溶剂沉析生物高分子时还应注意到某些金属离子的助沉作用，一些金属离子如Zn2+、Ca2+等可与某些呈阴离子状态的生物高分子形成复合物。这种复合物的溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉析形成，并降低有机溶剂的耗量，0.0050.02molL的Zn2+可使有机溶剂用量减少l3至12,使用时要避免会与这些金属离子形成难溶盐的阴离子(如磷酸根)的存在。,有机溶剂沉析的应用 （一）有机溶剂沉析的特点 优点：分辨能力比盐析高,即一
9、种生物分子或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析；沉析不用脱盐，过滤比较容易。 缺点：是某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。,（二）应用 有机溶剂沉析技术经常用于蛋白质、酶，多糖和核酸等生物大分子的沉析分离。使用时先要选择合适的有机剂，然后注意调控样品的浓度、温度、pH和离子强度，使之达到最佳的分离效果。沉析所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉析物，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱除有机溶剂，以免影响样品的生物活性,三、等电点沉析 等电点沉析原理 调节两性生化物质溶液的pH值，以达到某一生化物质的等电点，使其从
10、溶液中沉淀析出而实现分离的技术称为等电点沉析技术。 等电点(pI)是两性物质在其质点的净电荷为零时介质的pH值,溶质净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低,等电点沉析的注意事项 （一）等电点的改变 （二）目的物的稳定性 （三）盐溶作用 （四）pH的调节,等电点沉析的应用 （一）在生化产品的分离纯化过程中，常利用两性物质如氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等具有不同的等电点的特性来进行产品的分离纯化。 （二）等电点沉析只适用于水化程度不大，在等电点时溶解度很低的物质，如四环素等在等电点(pH=5.4)附近,难溶于水，能产生沉析。 （三）等电点沉析对
11、很多蛋白质不适合：目标蛋白质浓度低只靠调节ph难以沉淀，同时在等电点时不稳定易变性。 所以常与其他沉淀方法联用。如盐析,有机聚合物沉析 有机聚合物沉析原理 利用生物分子与某些有机聚合物形成沉淀而析出的分离技术称为有机聚合物沉析。 高聚物的分子量越高，沉淀效果越好，所需高聚物的浓度越低：如PEG4000沉淀某蛋白的浓度是0.25g/ml,而PEG2000是5% 优点：,有机聚合物沉析 优点：工艺简单、所需高聚物的浓度低、不会对产品质量产生影响、一般没有变性作用 缺点：高聚物成本高、难于回收。 主要用于实验室和处理价值高的蛋白质分离,有机聚合物沉析的应用 非离子型聚合物最早在20世纪60年代时被用
12、来沉析分离血纤维蛋白原、免疫球蛋白，和沉析一些细菌与病毒，近年来广泛用于核酸和酶的分离纯化。,其他沉析技术 一、金属离子沉析 （一）许多生物活性物质（如蛋白质、核酸、多肽、抗生素和有机酸等）能与金属离子形成难溶性的复合物而沉析。 （二）金属离子沉析生物活性物质已有广泛的应用，如锌盐可用于沉淀杆菌肽和胰岛素等，CaCO3用来沉析乳酸、枸橼酸、人血清蛋白等。此外，该技术还能用来除去杂质。,二、有机酸沉析 含氮有机酸如苦味酸和鞣酸等能够与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。 但这些有机酸与蛋白质形成盐复合物沉析时，常常发生不可逆的沉析反应。工业上应用此法制备蛋白质时，需采取较温和的条件，有时还加入一定的稳定剂，以防止蛋白质变性。,三、选择变性沉析 选择变性沉析法原理是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏 感性不同，而有选择地使之变性沉析，以达到目的物与杂蛋白分离的技术，称为选择变性沉析。 1、选择性热变性 2、选择性酸碱变性 3、选择性变性剂,
