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1、第六章 植物离体培养育种 Tissue culture and breeding,1 植物离体培养发展简史、意义和生物学原理,组织培养的概念,组织培养（Tissue culture）是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（In vitro culture）。,利用植物体的器官、组织或细胞，通过无菌操作接种于人工配制的培养基上，在一定的光照和温度条件下进行培养，使之生长发育的技术称为组织培养,按培养材料分为（Gamborg等)：,组织培养的类型,愈伤组织培养 细 胞 培 养 器 官 培 养 原生质体培养,最为常见的组织培养,
2、悬浮细胞培养 单细胞培养,胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养,类别 依外植体的不同划分,胚胎培养 （embryo culture）未成熟或成熟了的胚 器官培养（organ culture）根尖、茎尖、子叶、叶片、叶原基、花原基、或花果的未熟部分 组织培养或愈伤组织培养（狭义，tissue culture）维管束形成层、贮藏薄壁组织及愈伤组织等 细胞培养 单个游离细胞 （分离出的体细胞/花粉细胞/卵细胞） 原生质体培养 除去细胞壁的原生质体,植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术，近三十年来由于组织培养基础理论研究的深入，发展极为迅速，发表的文献浩如烟海，几乎以植物为研究
3、对象的各个分支学科都在广泛进行组织培养。,发展简史,1838-1839年，德国科学家Schleide 和Schwann发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。 1902年，德国植物学家Haberlandt 根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）理论。 1904年，Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。 1922年，Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。 1934年，White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。,1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出
4、胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定了基础。 1962年，Murashinge 和Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。 1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。 1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。,发展简史,植物组织培养在技术上的发展,研究材料范围逐步扩大 培养方法逐步完善 培养基不断改进 实验手段逐步完备,胚、胚轴、子叶、幼苗、茎尖、根、叶等；,动物细胞+植物细胞/微生物原生质体,固体
5、培养发展到液体振荡或旋转培养,悬浮培养、液滴培养、双层培养、包埋培养,White培养基、MS培养基、MT培养基等,植物组织培养在农业上的应用,倍性育种：花药培养、胚乳培养,突变体筛选：愈伤组织培养,创造新种质：细胞融合,克服胚败育：胚培养,植物性药物和生物制品的生产,组织培养的意义,胚胎培养 主要克服远缘杂交中胚不能在种子中正常发育而早期败育的问题。 胚珠和子房培养 进行试管内受精和杂种胚的分化成长，以克服不育性和不亲和性等障碍。 细胞及组织培养 进行优良单系的快速繁殖，自交不亲和系、雄性不育系的无性繁殖，突变体的诱导与分离及种质的保存和运输等方面。 花药及花粉培养 单倍体育种，加速获得纯二倍
6、体。 原生质体培养 进行体细胞杂交、核移植和核置换等工作。,愈伤组织培养是最为常见的组织培养方式？,愈伤组织（Callus）： 原指植物在受伤后，于伤口表面形成的一团薄壁细胞。,在组织培养中，指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。,原因： 大部分组织培养经历callus再生途径长出植株； callus可以用于悬浮培养和原生质体培养。,按培养方法：固体培养、液体培养、看护培养、微室培养、包埋培养等,按培养过程：初代培养、继代培养,组织培养的类型,外植体（Explants）,由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官,初代培养（Primary culture）,继代培养（
7、Subculture）,指外植体的最初培养,将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中，这种反复多次移植的培养，称为继代培养,生物学原理,植物的再生作用：植物的根、茎、叶等器官、组织和细胞都具有再生成完整植株的能力。其是无性繁殖的基础，它是受内源激素调控的。人工控制和调整培养基成分，可使其发育成完整的植株。 细胞的分化和形态发生：指细胞在分裂过程中发生结构和功能方面的改变，从而在植物个体发育过程中形成各类组织和器官，完成整个生活周期。,植物细胞的全能性（totipotent）：是指植物每个细胞都 具有该植物体的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。,原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全
8、套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。 差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。 潜在全能性的原因：基因表达的选择性 科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。,生物学原理,植物细胞全能性的表达,脱分化（dedifferentiation)：将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。 再分化（rediffer
9、entiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。,植物组织培养过程,植物组织培养特点,培养条件可以人为控制 组织培养摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。 生长周期短，繁殖率高 植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高
10、度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。,技术用途,快繁：人工种子、茎尖培养 脱毒：微芽嫁接、茎尖培养 克服杂交不亲和：花药培养、细胞 融合 种质资源保存和交换：愈伤组织培养、茎尖培养,MS培养基 它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。 B5培养基 是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可
11、能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。,一、目前国际上流行的培养基及特点,2 植物离体培养需要的基本条件,White培养基 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MsSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。 N6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。 KM8P培养基 它是1974年为原生质体培养而
12、设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。,包括无机成分和有机成分。无机成分包括大量元素和微量元素。有机成分主要包括糖类、维生素、氨基酸和酰胺类、含氮碱基、生长调节剂、自然复合物（如水解蛋白、酵母提取物、果肉和果汁等）以及其他成分如琼脂等。,培养基的基本成分,植物对无机盐类的需求具有广泛的一致性，偶然加以变动。一般多采用蔗糖。维生素中最关键的是B1，一般用量为0.1-0.4毫克/升。氨基酸和酰胺只用于某些组织培养，而在器官增殖阶段加入腺嘌呤也可能是需要的。关键的有机成分主要是激素和细胞分裂素。,培养基成分的性质,可以采用固体或者液体培养基，根据不同植
13、物和不同培养阶段而定。固体培养基中以琼脂质量好，配制时可以通过调节pH值来达到适合的凝胶状态即可。液体培养基养时也有固定和搅动两种。,培养基的物理性质,大量元素,N、P、S、K、Ca、Mg,N：各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要成分 Ca：细胞壁稳定 Mg：酶及辅酶的成分,微量元素,Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo,用量少，过多容易导致中毒,激素,细胞分裂素 赤霉素 生长素,促进细胞分裂和分化不定芽 6-BA、KT、ZA、2iP,诱导细胞的分裂和根的分化 IBA、IAA、NAA、2,4-D IBA、IAA和IAA诱导生根，2,4-D诱导愈伤组织,抑制愈伤组织形成，促进芽的形成GA3,几种激
14、素的配制方法,生长素 细胞分裂素 赤霉素,95%的酒精或0.1mol/L的NaOH或KOH,0.5或1mol/L的HCl+微热,溶于水，pH5.7但不稳定，用95%的酒精,IAA母液（stock solution）每周制备新鲜备用，容易见光分解（几天内），也容易被植株组织在几小时到几天内分解。生长素110-120C稳定保存1小时，但IAA可以被低pH、光、氧和过氧化物破坏。NAA和2,4-D比IAA稳定。,CTK母液可以在冰箱中保存几个月，在长时间的实验中，也可能被分解。 KT和ZT在120C处理1小时仍能稳定存在，BA100C时20分钟。,在碱性条件下，GA变成无活性的异构体，在强酸性环境和
15、高温下，GA也变成无活性的形式。GA热不稳定，114C处理20分钟降低其活性达90%，母液需制备新鲜的，并且采用过滤灭菌。,激素配比模式,生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。,生长调节物质的使用甚微，一般用mgL表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05-5mgL，细胞分裂素0.0510mgL。,Growth medium is optimised for regeneration of p
16、lantlets,No sucrose (0%),Sucrose reduced to 1%,Sucrose increased to 5%,The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface,Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.,Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured,Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium,tissue culture in
