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1、条斑紫菜多糖的提取纯化及其体外抗肿瘤活性研究摘要本文优化了超声波或微波辅助同时提取条斑紫菜(尸口rP妙rayezoensis夕多糖和藻红蛋白的工艺,采用三氛乙酸和藻胆蛋白变性温度结合的方法去除蛋白,并用膜分离技术对多糖进行初步分离,根据带电性质和分子量采用DEAEC一52和SePhadexG一100纯化出三种不同的多糖组分PYPSlla!PYPSla和PYPSZa,研究了这三种多糖的结构,单糖组成及PYPSlla和PYPSZa这两个多糖组分的Invitro杭肿瘤活性.主要研究结果如下:1!本文首次明确提出超声波辅助同时提取条斑紫菜多糖和藻红蛋白的最佳提取条件为:超声6Omin,功率88OW,3
2、0e水浴4h,料液比1:50,多糖提取得率为34.03%,藻红蛋白提取得率为1.20%,藻红蛋白纯度为0.3562!本文首次明确提出微波辅助同时提取条斑紫菜多糖和藻红蛋白的最佳提取条件为:微波4min,功率巧OW,30e水浴sh,料液比l:40,多糖提取得率为16.94%,藻红蛋白提取得率为0.417%,藻红蛋白纯度为0.255与对照(30e水浴sh,料液比1:40,多糖提取得率为10.50%,藻红蛋白提取得率为0.324%,藻红蛋白纯度为0.215)相比,超声波辅助提取多糖提取得率增加23.5%,微波辅助提取多糖提取得率增加6.4%3!本文研究得出了三氛乙酸和藻胆蛋白变性温度结合法去除蛋白的
3、最佳条件为:三氯乙酸浓度2%,50e处理20min,蛋白清除率99.63%,多糖保存率90.49%,与传统的三氛乙酸除蛋白法(三氯乙酸浓度3%放置lh,蛋白清除率为91.24%,多糖保存率为82.84%)相比,三氛乙酸和藻胆蛋白变性温度结合法去除蛋白效果更好,蛋白清除率增加8.39%,多糖保存率增加7.65%4!通过对超滤膜孔径的筛选,确定截留分子量分别为50kDa和3kDa的膜采用DE规e一52和s叩hadexe一100对50kDa和3kDa两个条斑紫菜多糖(P钾S)组分进行纯化,得到三个单一多糖组分PYPSna!PYPSla和PYPSZao5!紫外光谱分析表明PYPSlla!PYPSla和
4、PYPSZa不含核酸和蛋白质,是单一组分红外光谱解析表明PYPSlla!PYPsla和PYPSZa呈现出多糖的特征吸收峰,均为毗喃糖且含有硫酸基和3.6一内醚桥气相色谱法分析表明PYPSla和PYPSZa均由L一鼠李糖!D一半乳糖及三种未知单糖组成,半乳糖与鼠李糖的摩尔比分别为30:1和12.8:1;PYPSlla是由L一鼠李糖!D一半乳糖及四种未知单糖组成,半乳糖与鼠李糖的摩尔比为6.6:L6!PYPSlla和PYPSZa对人肝癌细胞A549的Invitro生长均有一定程度的抑制作用,并呈剂量依赖关系,在lm留mL时抑制率分别为43.1%和30.0%.关键词:条斑紫菜;多糖;提取;分离纯化;
5、结构分析;杭肿瘤活性EARCHONEXTRACTION,PURIFICAI,IONANDLV叮TROANTITUMORACTIVITYOFP01万SACCHARIDESFROMPOR只甘月汉ABSTRACTTheultrasonie一assistedormierowave一assisteds担ehronousextractionParametersofPolysaeeharideandPhyeoeryt断nfromPorphyrayezoensiswereoPtimized.Triehloroaeetieaeid(TCA)eombinedwiththedenaturationteirlPera
6、tureofphycobiliproteinwasusedtoremoveProteinandmembraneseParationteclmologywasusedtoisolatethePolysaecharides.ThreedifferentP而fiedfractionsPYPSIla!PYPSlaandPYPSZawerefurhterobtainedbasedontheirdifferentehargeeharaeteristieandmolecularweightbyDEAEC一52andSephadexG一100ehromato9即hv,respeetivel丫Thebasies
7、加cturesofthreemainfraetions,monosaceharideeompositionsandantltumoractivityofPYPS11aandPYPSZainvitrowerealsoinvestigatedinthePaPer.ThePrimaryresearehresultswereasfollows:1.hi面5PaPer,theoPtimumParametersforultrasonie一assistedsynehronousextractionofPolysaecharideandPhycoerythrinfromPorp冰ayezoensiswered
8、efinitelyPresentinfirsttime.TheoPtimumeonditionwasasfollows:ultrasoniePower880W,ultrasonietime60min,waterextractingtemPeratUre30oCfor4hours,ratioofsolid一liquidl:50,theextractionPereentofPolysaecharideandPhycobiliProteinwasresPeetively34.03%and1.2%,Phycoeryt而nPuritywas0.356.2.InthisPaPer,theoPtimumPa
9、rametersformierowave一assisteds邓ehronousextractionofPolysaeeharideandPhycoeryt如nfromPorp冰ayezoensisweredefinitelyPresentinfirsttime.TheoPtimumeonditionwasasfollows:microwavePower150w,mierowavetime4min,waterextractingtemPerature30oCfor5hours,ratioofsolid一liquid1:40,theextraetionPercentofPolysaeeh而dean
10、dPhycobiliProteinwasresPeetively16.94%and0.417%,Phycoery.thrinPuritywas0.255.ComParedwithcontrol(waterextraetingtemPerature30oCfor5hours,ratioofsolid一liquidl:40,theextractionPereentofPolysaeeharideandPhycobiliProteinwasreSPeetively10.05%and0.324%,Phycoery.t而nPuritywas0.215),theextraetionPereeniofPol
11、ysaeeharideofultrasoie一assistedextraetionandmierowave一assisstedextractioninereased23.5%and6.4%,resPeetivel丫PYPSlla和PYPSZa对人肝癌细胞A549的Invitro生长均有一定程度的抑制作用,并呈剂量依赖关系,在lm留mL时抑制率分别为43.1%和30.0%.关键词:条斑紫菜;多糖;提取;分离纯化;结构分析;杭肿瘤活性第一章文献综述第一章文献综述1.1海藻的研究概况海藻(川gae或Seaweed)是海洋植物的主体,它属于低等隐花植物,主要分为四大类:蓝藻!红藻!褐藻!绿藻,另外还包
12、括硅藻!甲藻!金藻等微藻估计全世界海洋中生长有15000余种海藻=-随着科学领域的拓展和科研技术的进步,海藻由于其独特的结构特性和生理活性,越来越受到各国研究人员的重视综合不同海藻及其产品的开发研究,发现海藻的应用价值不仅体现在食用价值,还在生态环境保护!海洋药物!功能食品!动物饲料!生物活性物质开发应用!食品添加剂!化工业!有机肥料!食品包装材料!微生物培养基!化妆品以及生物能源等诸多领域和范围发挥日益重要的作用,体现出了巨大的应用潜力和极高的经济价值我国是海藻资源生产加工及利用的大国,海带(LaminariojoponicaAresch)产量名列世界首位,紫菜(Po净妙ra)产量同日本!韩
13、国并列为世界三大紫菜养殖国根据5中国海藻图谱6,我国的经济藻类有510种,其中蓝藻/种,红藻266种,褐藻115种,绿藻103种z进入21世纪以来,国家十分重视海藻资源的开发利用,将其列为我国重点研发项目据分析测定,海藻干物质中,粗蛋白含量多在10%48%,高者(如螺旋藻)蛋白质含量可达60%以上;含无氮有机化合物30%60%,主要为海藻胶!淀粉!甘露醇!纤维素等多糖;还含有种类繁多的矿物质元素如钙!钾!钠!镁!铁等,其中碘的含量为0.4%0.7%,是一类天然的人体补碘食品;同时海藻中还含有vA!vC!vE等多种维生素,也含有多种色素和许多能促进生物生长的活性物质3研究结果表明,不少食用海藻具
14、有防治胆结石!便秘!肠胃病,以及防癌抗癌,增强人体免疫力,降低血脂,预防动脉硬化和血栓的形成,降低血糖等药用功效l4,5,6,7,8目前,我国海藻加工业主要分三个层次:初加工!精加工和深加工初加工主要是将海藻干制,制成各种即食制品;精加工主要是对海藻进行脱水!冷冻!膨化!调味!切片等加工,制成相应的产品;深加工是以藻类为原料,经过充分的处理,将其中有价值的成分加以提取应用,加工成食品,如饮料,营养品(胶囊!口服液)等除此之外,海藻中的成分还可作为食品添加剂,药物,饲料等的来源1.2海藻多糖的研究概况多糖印olysaccharides)又称多聚糖,是由醛糖或酮糖通过脱水形成糖昔键,并以糖普键线性
15、或分枝连接而成的链状聚合物植物多糖广泛分布于生物体中,尤其是动物细胞膜!植物和微生物细胞壁中,是一类天然高分子多聚物,是构成生命的分子基础之一近几十年来,人们发现多糖除了作为生物体的能量来源,在生物合成反应以及在细胞间的识别!受精!胚胎形成!神经细胞发育!激素激活!细胞增殖!病毒和细菌感染!肿瘤细胞转移等许多基本生命过程中都发挥着重要作用9,l近年来研究发现,多糖是一种非细胞毒物质,具有多种生物活性如免疫调节!抗肿瘤!抗病毒!抗凝血作用!抗血糖作用!降血脂!抗衰老等作用功能,-l迄今为止已经有数千种多糖得以分离纯化和完成一级结构的确定但是因其结构测定方法繁琐复杂,所取得的进展相当缓慢因此,寻找新的具有高活性的多糖仍然是多糖研究领域的一大重点上个世纪以前,人们对多糖的认识仅停留在淀粉领域,它一直作为食物中的能量来源被人类所熟知随着科学技术的发展和科研领域的扩大,越来越多的多糖种类被人类所了解,如菌类多糖,海藻多糖等海藻多糖(Seaweedpolysaccharid)在海藻中含量丰富,约占干重50%以上海藻多糖与蛋白质!脂肪!核酸等其它生物大分子相比,具有更强的亲水性这表明,海藻
