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1、生产管理知识基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用引言基因工程是二十世纪七十年代发展起来的一种新型生物技术，其发展从根本上改变了生物技术的研究和开发应用模式。1972年美国的Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV40DNA、噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦佛大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素连个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞生。在二十世纪八十年代以来，随着大批大批成果的出现及应用，基因工程带来了一场新的革命。利用这些技术，可以
2、直接地、有针对性地在DNA分子水平上改造生物的遗传性状。通过转入外源基因，微生物和动、植物细胞可以产生出自身原来没有的蛋白质。同样，利用重组DNA技术，也可以使一些原来存在量极低但有重要工业或医学用途的小分子(抗生素)或蛋白质之外的大分子物质得以大量生产。特别是随着重组DNA技术的完善和发展，以基因水平为核心的现代分子定向育种技术越来越受到工业微生物育种学家的关注，并展示了良好的应用前景。1、基因工程育种基因工程育种是在基因水平上，运用人为方法将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一细胞，使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达引，与
3、前几种育种技术相比，基因工程育种技术是人们在分子生物学指导下的一种自觉的、能像工程一样可预先设计和控制的育种新技术，它可实现超远缘杂交，因而是最新最有前途的一种育种新技术。基因工程技术的全部过程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段与基因载体的体外连接、外源基因转入宿主细胞和目标基因的表达等主要环节。1.1基因工程育种的一般步骤是：(1)目的基因的获得：一般通过化学合成法、物理化学法(包括密度梯度离心法、单链酶法、分子杂交法)、鸟枪无性繁殖法、酶促合成法(逆转录法)、Norther杂交分析法、cDNA文库筛选法、杂交筛选法、编码序列富集(磁珠捕获)、产物导向法、Nod连接片段筛选法、外显
4、子捕获法及外显子扩增法、剪接位点筛选法、作图克隆法、杂交细胞克隆法、消减杂交法、相同序列克隆法、差异显示逆转录PCR法、显微克隆与微克隆法和插入诱变法等方法获得目的基因。(2)载体的选择：基因工程载体主要是质粒和病毒，载体一般为环状DNA，其要求有自我复制能力、分子小、拷贝数多、易连接和易筛选等特点。(3)重组子体外构建：主要方法有粘性末端连接法、平端连接法、人工接头连接法和同聚物加尾连接法。(4)重组载体导入受体细胞：其主要途径有转化、转导、显微注射、电穿孔法、快速冷冻法和炭化纤维介导法等。(5)重组体筛选和鉴定：以合适的筛选方法选择具有最佳性能的突变重组子，重组体筛选和鉴定主要通过表型法、
5、DNA鉴定筛选法，选择性载体筛选法、分子杂交选择法、免疫学方法和mRNA翻译检测法等方法来实现。1.2运用基因工程进行定向育种的新技术12.1基因的定点突变定点突变(sitespecificmutagenesis或sitedirectedmutagenesis)是指在目的DNA片断(例如：一个基因)的指定位点引入特定的碱基对的技术，其包括寡核苷酸介导的定点突变、盒式诱变以及以PCR为基础的定点突变。近十年来，定点突变技术获得了长足的发展，并且在此基础上又发展了很多新技术。例如：重叠延伸PCR法(OverlapExtensionPCR简称EOPCR)、大引物PCR法(MegaprimerPCR)
6、、一步重叠延伸PCR(OnestepOverlapExtensionPCR，简称OOEPCR)、单管大引物PCR(SingletubeMegaprimerPCR)、快速定点诱变法、多位点环状诱变法TAMS(TargetedAmplificationofMutantStrand)定点诱变技术。在这些技术中，单管大引物PCRTAMS定点诱变技术最为简单和适用，并得到广泛的应用。单管大引物PCRPicard等和HKe等分别建立了单管大引物PCR法。该法省去了传统上以PCR为基础的定点突变中第1轮PCR产物的纯化过程，实现了在同一管中先后进行2轮PCR反应的定点突变目标。在上述2组研究者建立的方法中，
7、后者提出的方案更加巧妙、简单(图1)。其只需设计Tm值不同的2个侧引物，在第1轮PCR反应中用Tm值低的侧引物(F1)和诱变引物，在较低的退火温度下进行扩增反应，产生大引物；然后再加入Tm值高的侧引物(F2)，在较高的退火温度下进行第2轮反应，扩增出含突变位点的整个DNA产物。Ke等在此方法中还提出了2条更为细致、有效的改进措施，使PCR产物的最终产量和纯度均有所提高。这2条改进措施为：(1)在第1轮PCR反应中，诱变引物的浓度仅为侧引物的1，以减少诱变引物在第2轮PCR中的干扰作用；(2)在第l轮PCR反应后，亦即第2轮PCR反应前，增加5个循环的不对称扩增，这有利于提高其后的扩增效率。这种
8、单管大引物法的优点是：实现了在同一管中先后进行2轮PCR反应，大幅简化了操作步骤，并且省时、省力。在对多个样品进行操作时，该方法的优点更为突出。在以PCR为基础的诱变方法中，该法是引入单位点突变最简单、最经济的方法。图1单管大引物PCR过程Figure1TheprocessofSingletubemegaprimerPCRTAMS定点诱变技术2003年，Young等报道了一种有目的地扩增突变链的定点诱变技术(Targetedamplificationofmutantstrand，TAMS)。该技术能够一次引入多个位点的突变，并且能够有目的地扩增突变链，从而使突变效率几乎达到100。该方法主要分
9、3步(图2)：(1)线性单链DNA模板的制备：通过线性PCR制备单链DNA模板；(2)突变链的合成：该步骤需用2个锚锭引物(即Anchor5和Anchor3)和多个诱变引物(Mut1和Mut2)。(3)有目的地扩增突变链：设计扩增引物(PCR5和PCR3)，使其3端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对，扩增引物只能退火到突变链而不是亲本链。在多位点的突变试验中，TAMS诱变技术应该是首选方法。定点突变技术已在蛋白质的结构和功能改造上取得了很大成功。例如，利用定点突变改变酪氨酰-tRNA合成酶的活性中心，从而使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫键，显著提高了该酶的稳定性。图2TAM
10、S定点诱变技术原理和操作过程Figure2TheprincipleandoperationprocessofTAMS12.2易错PCRDNA聚合酶在进行扩增目的DNA时会以一定的频率发生碱基错配，这一现象恰好提供了一种对特定基因进行随机诱变的可能方法。利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因随机诱变的技术就称为易错PCR(Error_pronePCR，简称EPPCR)。此方法的原理与操作如图3，其操作过程是在TaqDNA聚合酶催化的PCR反应体系中，利用Mn替代天然的辅助因子Mg，使TaqDNA聚合酶缺乏校对活性，同时使反应体系中各种dNTP的比例失衡，因此导致碱基的错配率大大增加，通常约为
11、0.1。另外，还可以在该反应体系中加入dITP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平。这种方法可以将错配率最大提高至20。孔荣等利用易错PCR使D-海因酶对底物的水解活性提高了2.4倍；黄瑛等用易错PCR使短小芽孢杆菌YZ02脂肪酶活性提高了1.31倍，Km值由8.24mmol/L降低至7.717mmol/L，在pH8.0时的稳定性也较野生型脂肪酶有所提高。图3易错PCR示意图Figure3Sketchoferror-pronePCR12.3DAN重排DNA重排(DNAshufling)技术是一种利用重组文库的体外定向进化技术，Stemmer于1993年首先提出。DNA重排的基本原理是首先将同源
12、基因(单一基因的突变体或基因家族)切成随机大小的DAN片段，然后进行PCR重聚。那些带有同源性和核苷酸序列差异的随机DAN片段在每一轮循环中互为引物和模板，经过多次PCR循环后能迅速产生大量的重组DNA，从而创造出新基因。其操作的原理和步骤如图4。图4DNA重排的原理及操作步骤Figure4TheprincipleandoperationprocessofDNAshufflingZhao等在此基础上发明了一种更加简化交叉延伸程序(STEP)(图5)。此技术是在一个PCR反应体系中以2个以上相关的DNA片段为模板进行PCR反应。引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性、短暂复性(延伸)过程。在
13、每一轮PCR循环中，那些部分延伸的片段可以随机地与含不同突变的模板进行杂交，使延伸继续，并由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复进行直到获得全长基因片段，重组的程度可以通过调整时间和温度来控制。此方法省去了将DNA酶切成片段这一步，致使DNA重排方法进一步简化。图5交叉延伸程序的基本过程Figure5Basicprocedureofstaggeredextensionprocess近几年来，提高DNA重排技术捕获变异的能力一直是研究人员努力的方向。Ostermie等以核酸外切酶代替DNaseI对靶序列进行消化，发明了递减法建立杂交酶技术（ITCHY)，使得非同源性序列间也能发生重排，扩大
14、了该技术的用途。Hiraga等开发的SISDC技术在组件内部引入了限制性内切酶识别标记，用相应的限制性内切酶代替DNaseI产生重排片段。Bergquist等开发的DOGS技术则是根据保守模体区序列特征设计简并引物，扩增出保守同源区后再用重排操作生成突变富集体。由于此方法是在突变耐受的保守区直接增加转辙组的几率，所以其产生的突变频率大大增加。DNA重排的最大特点是在反复突变过程中引进了重组这一自然进化中最重要的过程，而且其对可操作的靶序列的长度没有任何要求，可以达到几万kb。通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高，同时还打破了传统物种之间由于生殖隔离导致不能重组的界限。
15、12.4基因组重排基因组重排(genomeshufling)技术是受DNA重排的启发，于2l世纪出现的全基因组改组技术。这种技术将分子定向进化的对象从单个基因扩展到整个基因组，可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。首先，利用经典的诱变育种技术获得含有目标性状的基因组库，然后利用原生质体融合技术将这些发生正向突变的菌株的全基因组进行多轮随机重组，从而快速筛选表型得到较大改进的杂交菌种。该技术巧妙地采用了多轮循环原生质体融合技术，将各种亲本制成原生质体-融合-再生-再制成原生质体-融合-再生)，即递归原生质体融合(recursiveprotoplastfusion)的方法。Zhang
16、等于2002年首次报道应用基因组重排方法快速地使弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)产生泰乐菌素的能力得到提高。该方法以营养缺陷型为出发菌株，仅用了1年时间，通过两轮基因组改组就从24000株菌株中分离到2组共14株泰乐菌素高产菌株，其泰乐菌素产量高于通过经典诱变育种方法所筛得的生产菌株SF21，而后者(SF21)是用经典诱变育种方法在长达20年的时间中先后筛选过约个菌株后才获得的。由此可见，此技术大大减少了工作量，并缩短了筛选时间。四川抗菌素工业研究所的徐波等以产量性状为标记特征，应用基因组重排的方法在一年之内使替考拉宁产量提高了65.3。除上述技术外，近年来又出现了一些新技术，例如：部分基因片段改组、单链DNA家族改组(SSDNAs)、简并引物基因改组(DOGS)、瞬时模板的随机嵌合、单向引物的随机重组、自我复制、体外随机引发重组(RPR)、酶法体外随机
