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1、凝胶渗透色谱（GPC）,1.GPC的基本机理,凝胶渗透色谱是一种液相的色谱，原理是利用高分子溶液通过一根装填有凝胶的柱子，在柱中按分子大小进行分离。柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度很高的球形凝胶。其中的凝胶类型有很多，都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯乙烯凝胶）。然而无论哪一种填料，他们都有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞。尺寸不同的高聚物分子，按其分子大小能自由地渗透进和渗透出这些凝胶孔洞。凝胶孔洞于分子尺寸是相适应的，超过这个尺寸的大分子就不能渗透进去，它们只能随溶剂的流动而在凝胶粒子之间的空间中流动。因此，大分子比起小分子来说，在柱中的行程就短得多。
2、根据大小分子不同的行程就可以把混在一起的高聚物分子逐级分离开来，先分离出来的是大分子，较小的聚合物分子受到溶剂分子的排斥也随后分离出来，然后再用一定的方法检知每级中溶质的浓度和分子量。,根据这一经典原理，用于测定高聚物的分子量是很适宜的，因为它易于实现自动化，而且分析的重复性好。其流程与HPLC（high performance liquid chromatography）是一致的,2.凝胶色谱仪,依照凝胶色谱的特点，在测定聚合物分子量分布曲线时，需要同时测定每个级分的浓度和分子量，因此除了和一般HPLC中所用到的浓度检测器如示差折射、紫外等检测器外，还配有分子量检测器。分子量的检测方法主要有
3、两大类：一类采用间接测定法，另一类采用直接测定法，如粘度法和光散射法。,2.1间接测定法,这是通过测定淋洗体积推测相应的分子量。如用虹吸法或计滴法来测定淋洗体积。随着凝胶色谱的不断发展，仪器流动相速度的稳定性不断提高，也可以直接测定保留时间作为分子量标记。 间接法测定分子量的优点是仪器设备简单，但不能直接得出分子量的数值，需采用标准进行校正，数据处理较为复杂。,2.2粘度法,用自动粘度检测器测定柱后流出液的特性粘度。依照Mark-Houwink方程： 即可换算得出聚合物的分子量M。上式中，K和为常数，与聚合物类型、溶剂和溶液温度有关。已知K，值。可以算出绝对分子量，否则，只能推测出相对分子量。
4、 自动粘度检测器有两种型式：一种是间隙式，测定一定体积的淋出液流经毛细管粘度计的流出时间；另一种是连续式，测定柱后淋出液流经毛细管粘度计时在毛细管两端所产生的压差。,2.3光散射法,用此法可以直接测出淋出液中聚合物的重均分子量，是一种测定绝对分子量的方法。 该法所使用的仪器为小角激光光散检测器（low angle laser light scattering, LALLS），其工作原理如下：当光通过高分子溶液时，会产生瑞利散射，散射光强度及其对散射角（即入射光与散射光测量方向的夹角）和溶液浓度C的依赖性与聚合物的分子量、分子尺寸、分子形态有关，因此可用光散射的方法研究高分子溶液的分子量等参数。
5、,采用瑞利比R来描述散光： 式中Io和I分别代表入射光和散射光强度；r代表观测点与散射中心的距离。LALLS与一般光散射方法相比，其特点式可以在0和C0的条件下测定，使计算大大简化， R 和溶质的重均分子量Mw的关系为 式中，A2为第二维利系数，需事先测定，K为仪器常数：,式中，N为阿佛加德罗常数；使入射光波长；n是溶液的折光指数。当测定溶液的浓度C0时，该项液可忽略。这样式子可以化简为： 式中的C为流出液中样品的浓度。因此在GPC中，只要有浓度型检测器和LALLS联用，就可以直接测出液中样品的重均分子量。,3.凝胶色谱分离机理,3.1凝胶色谱的色谱过程方程 凝胶色谱柱是用多孔材料填充的，其分
6、离能力与填料孔径无关。 GPC柱的总体积有3部分组成，即填料骨架体积、填料孔体积及填料颗粒间体积。其中填料骨架体积对分离不起作用，柱空间体积主要由后两部分组成。因此当把色谱方程VRVM+KVS用于凝胶色谱时，VM代表填料颗粒间体积，VS代表填料孔体积，VR也称为淋洗体积。样品在分离过程中，大分子的保留体积为VM，小分子的保留体积为VM+VS。分配系数K在0到1之间。,3.2分离机理简介,在现在，虽然GPC已经得到了广泛的应用，但是就连基本的分理机理都处在百花争鸣的阶段。目前模型机理可分为4大类：,3.2.1平衡排除理论,这理论的主要依据是就是以色谱方程。它认为分离处于平衡时，即溶质在胶体孔洞内
7、的停滞时间大于它扩散入与扩散出孔洞所需的时间分离的过程就既不受扩散控制也不受扩散影响。胶体的孔洞具有一定的孔径分布，大分子可以渗透进去的孔洞数目比小分子少，即排除体积大。同时，大分子渗透进孔洞的深度也比小分子浅，容易被淋洗液冲出来。所以在色谱柱内，大分子经过的路程比小分子短，先流出来，而小分子后出来。当溶质分子相当大时，以致全部都被排斥在胶体孔洞之外，K=0，即VRVM。而当溶质分子相当小时，K1，VRVM+VS。,3.2.2限制扩散理论,该理论认为分离不处于平衡态，即溶质分子扩散入与扩散出孔洞的时间近乎它的停滞时间。胶体孔洞内部的流体摩擦效应是溶质的扩散速度降低，溶质分子越大则摩擦效应就越大
8、。因此，大分子难于向孔洞内扩散渗透，先被淋洗出来。,3.2.3流动分离理论,流动分离理论的模型把填料的孔洞假设成细长管子。当溶液在细长管子中高速流动时，就存在这流速长场，即管子中间的液体比靠近管壁的液体流动快，就形成一个抛物线的流速场。 由于半径大，大分子的溶质在流动时不能靠壁而被集中到管子的中心区域，故靠近管壁的是小分子。在抛物线形流速场的影响下，中心区域大分子的流速较快，从而先从柱子中流出来；小分子靠近管壁流速慢，经过足够长的距离后就可以到达分离的目的。,3.2.4 热力学理论,该理论认为，决定GPC分离的因素，不仅有胶体的孔径大小，而且包括在一定溶剂中高聚物分子构像的尺寸分布。Casas
9、sa研究了溶液中不同构像的分子链在同一胶体孔洞大小上的分离他假设孔洞内外的溶质分子处于平衡，而且两相是那样的稀,以致高聚物之间无作用。他用无规飞行统计来描述分子的构像，即符合方程式： 式中，Pn（r）表示距坐标原点为矢量r的位置上，无规飞行出现n次的几率密度；b2表示聚合物链段的平均平方长度。上式在分散（dissipative）物理过程中是基本的，适用于各种边界条件。,4.数据处理,4.1凝胶色谱谱图 凝胶色谱谱图与一般的色谱谱图是一样的，横坐标代表色谱保留值，纵坐标代表流出液体的浓度。因此横坐标的值表示了样品的淋洗体积或级分，这个值是与分子量的对数值成比例的，表示了样品的分子量；纵坐标的值是
10、与该级分的样品量有关，表征了样品在某一级分下的质量分数。因此凝胶色谱谱图可看作是以分子量的对数值未变量的微分质量分布曲线。,对于单分散相的高聚物样品，其色谱的保留值（在凝胶色谱中称为峰位值）即表征了样品的分子量。一般这种单分散性的色谱曲线可以用高斯分布函数表示： 式中，V为淋洗体积；Vp为色谱峰的峰位淋洗体积；W(V)为样品的质量函数；W0为样品质量；为标准偏差。,对于多分散性样品，其凝胶色谱曲线是许多单分散性样品分布曲线的叠加，如下图所示。曲线下面的面积正比与样品量，是各单分散性样品量的总和。这种曲线的形状不一定与高斯分布函数一致，而是你和样品的分子量分布状态有关，因此色谱峰的峰位不直接表示
11、样品的平均分子量。在这种情况下，需通过数据处理来获得平均分子量。,4.2分子量校正曲线,由凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化为分子量M，这种分子量的对数值与淋洗体积之间关系曲线（lgMV曲线）称为分子量校正曲线。该曲线测量的精度直接影响到凝胶色谱测定的分子量分布精度，因此分子量校正曲线的确定成为凝胶色谱中关键的一环。 校正曲线的测定方法很多，大致可分为两大类即直接校正法和间接校正法。,4.2.1单分散性标样校正法,选用一系列与被测样品同类型的不同分子量的窄分散性（d1.1）标样，先用其他方法精确地测定其平均分子量，然后与被测样品在同样条件下进行GPC分析。每
12、个窄分布标样的峰为淋洗体积与其平均分子量相对应，这样就可做出lgMV曲线如下图所示。,在上图中A点称为排斥极限，凡是分子量在比此点大的分子均被排斥在凝胶孔之外；B点称为渗透极限，凡是分子量小于此值的都可以渗透如全部孔隙。,对于线性校正曲线可用下列方程表示： 式中，Ve为淋洗体积（也可用保留时间）；M代表分子量；A和B为常数，B0。 如果校正曲线是非线性的，则可用曲线方程或多段折线方程表示。 这种测定校正曲线的方法简便，准确性高，但获得于被测样品相同类型的窄分布高分子样品比较困难，限制了它在实际中的应用。,4.2.2渐近试差法,在实际工作中，有时不易获得窄分布的标样，可选用23个不同分子量的聚合
13、物标样（平均分子量需精测量，为已知的）采用一种数学处理方法即渐近试差法。可计算出校正曲线，由于这种方法不需要窄分布样品，因此也可称为宽分布样品测定校正曲线法。 先对已知样品进行GPC分析，得到GPC谱图，然后依照线性校正曲线任意规定一组A和B的值，得到一条校正曲线，依照此方程计算已知标样平均分子量，把所得到的数据与原始数据进行比较，如不符合再修正A、B值，再重新计算，这样反复试差，直至计算出的结果与已知标样相差在允许的误差范围内（一般小于510），即可确定校正曲线。这种方法用手算是比较麻烦的，目前已能编制成程序由计算机来完成。 渐近试差法的优点是不需要窄分布标样，实验操作方便，其缺点是不能凝胶
14、柱的排斥和渗透极限，只能适用与线性的校正曲线，得到的校正曲线也只是近似的。,4.2.3普适校正法,GPC反映的是淋洗体积与高聚物流体力学体积之间的关系。各种高聚物的柔顺性是不同的，分子量相同而结构不同的高聚物在溶液中的流体力学体积也是不同的。因此由上述方法介绍的两种方法所确定的校正曲线只能用于测定与标样同类的高聚物，当更换高聚物类型时，就需要重新标定。如果校正曲线能用高聚物的流体力学体积来标定，这类校正曲线就具有普适性。 如果用lgMV作校正曲线应该比lgMV的校正曲线更具普适性，也就是说，不同的高聚物，在相同的GPC实验条件下，当其淋洗体积相同时，下式成立：,把MarkHouwink方程：代
15、入上式再经过一些公式的化简可得： 因此只要知道两种聚合物样品在实验条件下的参数K1，1和K2，2的值，就可由一种高聚物的校正曲线以上式换算成第二高聚物的校正曲线。 此方法的优点是主要一种高聚物（一般采用窄分布聚苯乙烯）作校正曲线就可以测定其他类型的聚合物，但先决条件式两种聚合物的K和必须是已知的，否则无法进行定量计算。,4.3分子量分布的计算,单分散性样品只有测出GPC谱图就可以从图中求出保留值，然后直接从校正曲线查出对应的分子量。 计算多分散性样品分子量分布由两种方法：一种是函数法，另一种是条法。,4.3.1函数法,这种方法是先选择一种能描述测得的GPC曲线的函数，然后在依据此函数和分子量定
16、义求出样品的平均分子量。在实际中由于许多聚合物谱图是对称的，近似于高斯分布，因此应用最多的是用高斯分布函数来描述。,为了能够更好的表示出分子量，将高斯公式进行化简： 式中，B12.303B。 则可以得到分子量为自变量的质量微分分布函数 ： 其中B1；MP为峰位分子量，可由校正曲线中查出。将其代入 和d的定义中可得到：,4.3.2条法,当谱图不对称或出现多峰时，就不能近似成高斯分布函数，则上式不适用 。 把GPC曲线沿着横坐标分成n等分，然后切割成为与纵坐标平行的n个长条，相当于把整个样品分成n个级分，每个级分分淋洗体积相等。 由GPC谱图上可以求出每级分的淋洗体积Vi和浓度响应值Hi。再通过校正曲线求出i级分的分子量Mi，级分的质量分数可由下式求出： 样品的平均分子量可按照统计平均分子量的定义计算。,这种计算方法的优点是可以处理任何形状的GPC谱线的数据，但应注意选取数据点数，数据点太少，计算精度不够；太多占用计算机大量的内存量，也浪费计算时间。一般，如果精度要达到2，一般只要选择20个点就够了，但计算和则需要选取40个数据点。当然在使
