免疫组化课件

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1、免疫组织化学技术 (immunohistochemistry),一、定义及其发展： 免疫组织/细胞化学(immunohisyo/cyto- chemisty)是组织化学技术的分支，它是用已知并标记的特异性抗体（抗原）对组织（细胞）内的抗原（抗体）的存在及分布进行组织原位的定性或定量显示。原位免疫学(in situ immunology),其特点： 高度特异性 高度敏感性 方法和过程统一 形态、机能、新陈代谢等生命活动相结 合。,因此免疫组织（细胞）化学技术已被 广泛用于生命科学的研究。 Coons及同事们于1941年首次用荧光素标记抗体检测肺炎双球菌获得成功，开 创了组织化学中免疫组织化学技术

2、的新篇章。,Nakane 1968 建立酶标抗体（抗原） 技术。 Stermerger 1979在此基础上改良并建立 了HRP抗 HRP方法（ PAP） 技术 ，使免疫组织化学得到 日益的发展和运用。 Hsu 等 1981 年建立卵白素生物 素HRP复合物法（ABC 法）。,此后： 免疫金银染色方法 半抗原标记法 免疫电镜技术等相继问世 这些方法目前已成科学研究中的一项 有力工具。,免疫组织细胞化学技术的全过程包括： 1. 抗原提取和纯化： 2. 免疫动物： 3. 抗体的分离、提取、纯化和效价的确 定：,4. 标记抗体： 5. 标本制备： 6. 免疫反应过程： 7. 观察及结果判断与分析：,二

3、、有关免疫学的基本知识 （一）抗原（antigen,Ag） 1. 抗原的定义： 2. 抗原的性质：, 异种异体物质 大分子胶体 抗原的特异性 3. 种类 ： 全抗原 不全抗原/半抗原,(二) 抗体（antibody,Ab） 1. 定义： 2. 性质： （1）一般性： （2）抗原性：,3. 抗体的种类： 免疫抗体： 天然抗体： 自身抗体： （三）抗原与抗体的反应 抗原与抗体的结合是高度特异性的结合。 一个抗体分子有两个抗原结合点，称为 两价。有多个结合点称为多价。抗原与 抗体反应不受两者数量比例限制，但如,果需要出现肉眼可见的反应，则抗原与 抗体的 量要保持一定的比例。 3. 主要的血清学反应有

4、三种类型： 凝集反应： 沉淀反应： 有补体参加的各种血清反应：,（四）抗体形成的机理 1. 免疫反应的形成：可分三个阶段： （1） 致敏阶段： （2）反应阶段： （3） 效应阶段：,2. 影响抗体产生的因素 （1）抗原的质和量 （2）机体方面 免疫途径 免疫次数及间隔 机体处于发育的不同阶段、 免疫细胞对抗原刺激的反应不 同。,（五）抗体的来源 1. 市售抗体： 2. 自制抗体：,（1）制备过程： 抗体分离、提取与纯化。 用抗原免疫动物。常用动物：兔 抗体的分离、提取与纯化，兔抗 一抗,一抗作为抗原再免疫动物。 常用动物： 羊。 羊抗兔抗体的分离、提取与纯化 （羊 抗兔）二抗。 （2）抗体的标

5、记：,常用的标记物有： a. 荧光素：荧光抗体： 异硫氰酸荧光素（FLTC）： 四乙基罗达明（RB200）： 四甲基异硫氰酸罗达明（TMRITC）： b. 酶：酶标抗体： 前面介绍的四种酶均用于标记抗体， 但常用的是辣根过氧化物酶(HRP) 。,c. 抗生物素生物素HRP： 生物素与二抗结合生物素标记二抗， 生物素与HRP结合生物素标记HRP。 使用前： 生物素标记HRP+ 抗生物素 形成抗生物素生物素HRP复合物 ABC复合法 d. 金属：常用的金属有金、银、铁。一 般光镜下不用，作免疫电镜时，才使,用金属标记，金属致密，在电镜下离子 密度高，便于区别。 金： 用溶胶状态的金胶体金。最常 用

6、。 银：很少用。 铁：一般不能直接用于标记抗体。常用 铁蛋白，建立免疫铁蛋白技术。,（六）抗体的配制 1. 抗体分装贮存： 2. 抗体使用液的配制：,（1）抗体最佳稀释度的测定方法： （2）方阵测定法： （3）抗体稀释液的配制：常用0.01mol/L PH=7.4PBS/TBS(Tris缓冲生理盐水) 缓冲液作稀释液。,（七）免疫染色/免疫反应： 抗原一抗体反应： 一般程序是： 标记抗体与标本中的抗原结合。 PBS冲洗未结合的抗体。,直接观察或显色后观察结果。 减少非特性染色的方法有： 1. 增强特异染色的方法： 蛋白酶消化法： 合适的抗体稀释液： a. 抗体效价的高低。,b. 温育时间的长短

7、。 c. 抗体的纯度。 d.稀释液的种类、标本制作等方面。 温育的时间长短 30604 过液。 多层染色，提高敏感度。,2. 减少或消除非特异性染色： 3. 显色反应的控制： 3. 复染：,（八）对照,主要是针对第一抗体对照。 1. 阳性对照： 2. 阴性对照： 3. 假阳性对照： 4. 假阴性对照：,三、常见的免疫组织化学方法 免疫反应的基本步骤： 1. 处理切片，封闭内源性物质和避免交 差反应。 2. 1抗孵育切片，湿室，37，3060分 钟。,3. PBS漂洗，3次5分钟。 4. 2抗孵育切片，湿室，室温，3060 分 钟。 5. PBS漂洗，3次5分钟。,6 .呈色： 0.010.1

8、%H2 O2 + 0.010.05% DAB + 0.050.01mol/L tris-HCl (PH7.4)。 室温，35分钟，避光。,7. 漂洗。 8. 复染。 9. 漂洗。 10. 脱水、透明、封片。 11. 光镜观察、记录、显微照片。,（一）免疫荧光组织/细胞化学技术 (immunofluorescence histo/cytochemistry) 由Coons 创立于1941年 1. 原理： 采用荧光素标记二抗，经过免疫反应, 利用荧光显微镜观察标本。,2. 过程/步骤： （1）切片（冰冻切片，石蜡切片脱蜡。 用冷4 PBS漂洗3次5）。 （2）滴加1抗，温室内，37 ，30 （3）

9、冷PBS漂洗3次5。,（4）滴加标有荧光素的2抗，湿室，室温 30或4 过液。 （5）冷PBS漂洗3次5。 （6）荧光显微镜观察及摄片/封固后观察。,注意事项: PH值，接近抗体环境为佳。 加二抗之前，将二抗离心去除沉淀物 注意切片是否放平，保证抗体覆盖标本,反应中，标本一定保持在一定的湿度内进行，从而防止标本变干。 温度一般在37或室温内进行，如果待查抗原耐热能力差，可在4 下进行，但要延长作用时间。,漂洗一定要干净。 切片不干时，就观察或封固。 同时设对照染色，用正常血清代替荧光体，结果为阴性。,（二）免疫酶标组织/细胞化学技术 (horseradish peroxidase labell

10、ed histo/cytochmistry method) 1. 原理： 在二抗上标记HRP。 2. 步骤：同基本步骤,（三）过氧化物酶一抗过氧化物酶法 (peroxidas-antiperoxidas complex method) : PAP法。 1. 原理： 2. 步骤：同基本步骤,不同的PAP复合物。,3. PAP法的特点： 抗体活性高： 灵敏度高：,背景染色浅，有利于观察和记录。 问题： 4. 注意事项：,（四）抗生物素生物素复合技术 （avdin-biotin-peroxidase complex method，ABC） 1.原理：ABC 法由Hsu建立于1981年。 生物素： 抗

11、生物素：,2.步骤：同基本步骤,不同的ABC复合物。 3.优点： 敏感性强。 特异性强，背景染色浅。 方法简单，节约时间。,ABC试剂盒国内已大量生产，价 格 适中。 生物素具有与多种显示剂结合的 能力，可用作双重或多重免疫染色。 4. 注意事项：,LAB法：标记亲和素-生物素法,ABC法：亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法,（五）SPA免疫组织/细胞化学技术 (SPA-immunohisto/cytochemistry method) 1. 原理： SPA(staphylococcal protein A)的特征： 2. 步骤：,（六）免疫电镜技术(immunoelectron micros

12、copy) 1. 分类： 免疫电镜技术 Singer于1959年首创， 他是用电子密度很高的铁蛋白的标记抗体， 作细胞表面抗体定位研究。后来有学者根 据标记物将电镜技术分类。,（1）铁蛋白标记免疫电镜技术： 铁蛋白分子量大，很难穿过细胞。主 要用于细胞表面抗原的定性、定位研 究。,铁蛋白的电镜图像呈颗粒状，大小均一 致，电子密度高，易于电镜下直接观察。 （2） 酶标记免疫电镜技术 辣根过氧化物酶HRP，形成的复合物 电子密度高，易于观察。,（3）PAP法 特点： 稳定性高，特异性强。 1抗结合多个2抗，2抗又结合多个抗 HRP抗体，起到放大作用。,（4）胶体金免疫电镜技术 金标记法是Faulk

13、和Taylor于1971年提 出的。 金颗粒是指1150nm颗粒分散在 水溶液中的金溶胶，带负电荷。 用免疫电镜技术金颗粒560nm市售金 颗粒一般在5nm，10nm，15nm，25nm。 优点：金颗粒电子密度高，清晰可辩，形态规则。,方法简单一些，不如PAP法复杂。 同一组实验，可用不同直径的金颗粒 可作多种抗原的区别研究，双标。 金标抗体能发生二次电子，可作用扫 描电镜观察。,2. 免疫电镜技术的基本步骤（PAP法） 基本要求： 保持超微结构完好，结构不改变。 又要保存最多的抗原及抗原活性。,1. 包埋前法： 实用于酶标法和PAP法。 （1）取材 固定 冰冻切片（40150m）。 （2）免

14、疫染色（同酶标法和PAP法）。,（3）电镜技术： 选择阳性部位，在解剖显微镜下， 取下阳性部位，裱于盖玻片上。 1%的锇酸固定，11.5h。,脱水。 平板包埋聚合。 修块、超薄切片（5080nm）、裱于 铜网。 重金属盐双重染色。 电镜观察、记录、照片。,优点： 形态结构好。 阳性部位容易确定，电镜下易找 到阳性结果。 时间短。,缺点： 样本制备困难。 切片困难，易损坏刀。 2. 包埋后法： 实用于铁蛋白及胶体金法。,（1）电镜技术：取材超薄切片 铜网。 （2）免疫染色（同前）。 （3）重金属盐双重染色。,（4）观察记录。 优点：制片容易，形态结构好。 缺点：抗原及活性损失大。 部位不准。 得

15、到阳性结果难度大。 3. 注意事项：,四、免疫组化技术的应用 （一）免疫组化在人体研究中的主要用途 1. 免疫组化在肿瘤病理学的研究和诊断 中的主要应用： （1）组织起源不明肿瘤的研究： （2）研究病原体与肿瘤的关系：,（3）协助确定肿瘤的良恶性： （4）测定肿瘤细胞的增殖活性： （5）分化差的癌和肉瘤的鉴别： （6）确定转移性恶性肿瘤的原发灶： （7）恶性淋巴瘤的诊断和分型： （8）为制定肿瘤的治疗方案提供依据： 2. 免疫组化技术在病原微生物的鉴定中 的应用：,3. 免疫性皮肤疾病在诊断中的应用： （二）中间丝蛋白的证明及其应用 1. 细胞骨架和中间丝蛋白： 2. 细胞角蛋白（cytokeratin, CK）: （1）组成和正常分布： （2）CK在肿瘤中的分布和CK在肿瘤 鉴别诊断中的应用：