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1、第七章 免疫诊断与防治,王 慧,第一节 免疫诊断,免疫学技术是当今生命科学实验研究的重要手段之一，临床上免疫学检测技术被广泛用于与免疫相关疾病的诊断、发病机制研究、免疫状态监测及疗效评估。,一、抗原与抗体的检测,(一)抗原抗体反应的原理和特点,1、特异性 2、可见性 3、可逆性,(二)抗原与抗体的检测方法,1、凝集反应,(1)直接凝集反应,不溶性颗粒Ag + Ab 电解质 凝集成团块 （凝集原） 凝集素）,(2)间接凝集反应,2、沉淀反应,(1)单向琼脂扩散 (2)双向琼脂扩散,(3)免疫电泳 (4)免疫比浊,单向免疫扩散,半固体凝胶 （掺入Ab）,孔中加入Ag,抗原扩散到孔外，与凝胶中抗体相
2、互作用，起初形成可溶性复合物，当抗原扩散达到与抗体等量时，产生晶格和沉淀。沉淀环直径与抗原浓度相关，可用标准曲线定量抗原。 在此基础上，引入电场使Ag由负极向正极扩散，形成锥形沉淀峰，即为火箭电泳。,双向免疫扩散,在双扩基础上加电泳，Ag孔置负极端，Ab孔置正极端，Ag带负电荷多于Ab，向正极泳动，Ab由正极向负极泳动，形成对流，比例适宜处形成沉淀线，为对流电泳。,免疫标记技术,1.免疫荧光法（immunofluorescence，IF） 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA） 3.放射免疫测定法（radio immunoassay，RIA） 4.化学发光免疫分析 （c
3、hemiluminescence immunoassay，CLIA） 5 免疫印迹法 （immunoblotting, Western blot),(1)免疫荧光法 ：直接法间接法,抗核抗体(FITC-IgG）),抗原抗体反应特异性 酶催化反应高效性,(2)酶免疫测定,酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),免疫组织化学技术 (immunohistochemistry technique) 定性、定量和定位Ag,ELISA,双抗体夹心法(测Ag) 间接法(测Ab),加Ab,清洗,加Ag形成复合物，洗涤,加该Ag的另一Ab（酶标），
4、洗涤,加底物，读数,加Ag，清洗,加Ab形成复合物，洗涤,加酶标二抗,加底物，读数,聚苯乙烯微量反应板,免疫印迹法,二、免疫细胞及其功能检测,(一)免疫细胞的类型与数量检测,1、E花结试验 2、尼龙棉分离法,3、免疫磁珠分离法4、流式细胞术,(二)免疫细胞功能测定,1、T细胞功能测定,(1)T细胞增殖试验 (2)细胞毒试验 (3)皮肤试验,2、B细胞功能测定,(1)B细胞增殖试验 (2)抗体形成细胞测定,3、细胞因子检测,外周血单个核细胞的分离,外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞
5、群，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。,外周血单个核细胞的分离,分离液,1.070g/l,1.0770.002g/l,1.092g/l,血液中PBMC的密度与其他成分不同： 血小板的密度为1.0301.035， 粒细胞为1.092， 红细胞为1.093， 淋巴细胞和单核细胞的密度为1.0751.090。 利用一种密度介于1.0751.092之间、近于等渗的溶液(分层液)进行密度梯度离心，可使不同类别的血细胞按其相应密度分布，从而被分离。 常用的分层液有聚蔗糖-泛影葡胺分层液法和Ficol分层液法两种。,单核细胞的获得,1粘附法 单核细胞和粒细胞具有粘附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶的特性，通过
6、PBMC与玻璃或塑料平皿的粘附作用，采集的粘附细胞即为淋巴细胞。,2羰基铁粉吞噬法 单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大，再经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。也可在单核细胞悬液内加入羰基铁粉颗粒，待单核细胞充分吞噬羰基铁粉后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。,淋巴细胞亚群的分离,淋巴细胞是复杂的不均一的细胞群体，它包括了许多形态相似而表面标志和功能各异的细胞群和亚群。根据细胞的表面标志和功能等不同，借助多种方法分离淋巴细胞亚群。,E花结实验 T细胞表面CD2分子+绵羊血红细胞玫瑰花结,尼龙棉柱分离法,将淋巴细胞悬
7、液加入尼龙棉柱内，B细胞易粘附于尼龙棉纤维(聚酰胺纤维)表面，而T细胞则不易粘附，由此可将T细胞与B细胞分离。 该法简便易行，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，所获T细胞纯度可达90%以上，B细胞纯度可达80%。,免疫磁珠分离法,包括直接法和间接法。 直接法是将特异性抗体与磁性微粒(平均直径小于1.5m)交联，形成免疫磁珠(IMB)。IMB与表达相应膜抗原的细胞结合，用强磁场分离磁珠结合细胞与磁珠非结合细胞，从而对特定细胞进行阳性或阴性分选。 间接法是用羊(或兔)抗鼠IgG抗体(第二抗体)包被磁性微珠，可与任何已结合鼠源性单克隆抗体(第一抗体)的细胞发生反应，从而对细胞进行分离。,磁分离技术
8、原理：,流式细胞术(Flow Cytometry, FCM) 是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。,流式细胞仪实验方法,细胞分选,细胞凋亡研究,血液学应用：包括DNA倍体分析及细胞周期分析，淋巴细胞亚群测定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，红细胞疾病诊断，血小板功能分析和血小板病诊断，微小残留白血病检测，白细胞吞噬功能测定，NK和LAK细胞活性测定，造
9、血干/祖细胞测定等,胞内细胞因子的检测：,淋巴细胞的功能检测,T细胞功能检测 B细胞功能检测 NK细胞活性测定,1、T细胞功能检测,T细胞增殖试验 细胞毒试验 皮肤试验,（一）T细胞增殖试验,T细胞在体外受到有丝分裂原或抗原的刺激后，细胞的代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应，如细胞变大、胞质增多、胞质现空泡、核染色质疏松、核仁明显，并转化为淋巴母细胞。 淋巴细胞增殖反应又称淋巴细胞母细胞转化。,常用刺激物,体外刺激T细胞增殖反应的刺激物包括 植物血凝素 (PHA) 刀豆素A(ConA) 美洲商陆(PWM) 白喉类毒素 破伤风类毒素 纯化蛋白衍生物(PPD
10、) 白色念珠菌,检测T细胞增殖反应,1形态学检查法 23H-TdR掺入法 3MTT比色法,1形态学检查法,分离PBMC，与适量PHA混合，置37培养72h。取培养细胞作涂片染色，借助光学显微镜进行检测。根据细胞的大小、核与胞质的比例、胞质的染色性以及有无核仁等特征(见图24-6)，分别计数未转化的淋巴细胞和转化的淋巴细胞，每份标本计数200个细胞，按公式计算淋巴细胞转化率。,转化率在一定程度上可反映细胞免疫功能，正常人的T细胞转化率为60%80%，小于50%可视为降低。 形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。缺点是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，
11、重复性和准确性较差。,2、B细胞功能检测,B细胞增殖试验 溶血空斑试验（抗体形成细胞测定） 酶联免疫斑点法,3、NK细胞活性测定,NK细胞表面至少存在CD2、CD11b、CD11c、CD16、CD56和CD59等多种抗原，但均非NK细胞所特有，现今极少以CD系列抗原为指标鉴定和计数NK细胞，而多检测NK细胞活性。 NK细胞具有细胞介导的细胞毒作用，能直接杀伤靶细胞。测定人NK细胞活性多以K562细胞株作为靶细胞，而测定小鼠NK细胞活性常采用YAC-1细胞株作为靶细胞。,4、吞噬细胞功能检测,吞噬细胞的吞噬运动大致分为趋化、吞噬和胞内杀伤作用三个阶段，可分别对这三个阶段进行功能检测。,NBT还原
12、试验,中性粒细胞在吞噬杀菌过程中，能量消耗剧增，耗氧量也随之增相应增加，磷酸己糖旁路的代谢活性增强，6-磷酸葡萄糖脱氢酶使葡萄糖的中间代谢产物6-磷酸葡萄糖氧化脱氢转变为戊糖。如加入硝基蓝四氮唑 (nitroblue tetrazolium , NBT)，则可被吞噬或渗透到中性粒细胞胞质中，接受所脱的氢，使原来呈淡黄色的NBT还原成点状或块状的蓝黑色甲月替颗粒，沉积于中性粒细胞胞质中，称NBT阳性细胞。,NBT阳性细胞百分率可反映中性粒细胞杀菌功能，正常参考值为7%15%，平均为10%。 慢性肉芽肿病患者NBT阳性细胞百分率显著降低，甚至为零。,第二节 免疫防治,天花,天花病毒 Smallpo
13、x virus,出疹的木乃伊（疑为天花）,躯干皮肤天花损伤,患天花的小儿 （Infant with smallpox）,1979年WHO宣布在全球范围内消灭了天花病毒。,脊髓灰质炎,患脊髓灰质炎的儿童 （Child with polio sequelae WHO） WHO 宣称将在2003年在全球消灭脊髓灰质炎,中毒,黑寡妇蜘蛛 黑寡妇症候群（影响神经）,Jenner 和 Pasteur , 著名的免疫学家，公认为免疫接种和主动免疫的先驱。,Edward Jenner,Louis Pasteur,疫苗接种实际效果,0 10 100 1,000 10,000 100,000 1,000000,白
14、喉 Diphtheria 1921,风疹 Rubella 1969,脊髓灰质炎 Polio (paralytic) 1952,百日咳 pertussis 1934,腮腺炎 Mumps 1968,麻疹 Measles 1941,报道的病例数 Number of reported cases,0 例,美国报道的几种病在高峰年 和1996年 的病例数相比,一、免疫预防（immunoprophylaxis）,免疫预防,人工主动免疫 人工被动 免疫,输入抗原（疫苗）,输入免疫效应物质（抗体）,主动建立长期的免疫应答,被动获得短期的免疫效应能力,慢、持久,快、短暂,主动免疫 被动免疫,疫苗,抗毒素 人免疫
15、球蛋白,灭活疫苗 减毒活疫苗 类毒素,病原体灭活,减毒活病原体,细菌外毒素,体液免疫,体液免疫、细胞免疫,抗细菌毒素抗体（动物血清）,1、安全 活疫苗要求遗传形状稳定，无返祖，无致癌性， 无热原性及过敏原。 2、有效 大多数人有保护性免疫，群体抗感染能力强。 理想的疫苗： 诱导体液和细胞免疫 维持时间长 3、实用 接种程序简化如：口服疫苗 无不适反应 易保存和运输,（一）、疫苗的基本要求,疫苗的应用,新型疫苗及其发展,基因工程疫苗 *重组抗原疫苗：用DNA重组技术制备只含保 护性抗原的纯化疫苗。 疫苗不含活病原体和病毒核酸，安全有效，成本低 *重组载体疫苗：将编码病原体有效免疫原的基因插入载体
16、 （病毒或细菌）的基因中，接种后随疫苗株在体内增殖而表达抗原 * DNA疫苗：将编码病原微生物有效的免疫原的基因插入到细菌质 粒 DNA中，建成重组质粒，再将其导入 组织细胞，使其表达保护性抗原，产生特异性免疫。如：HIV的疫苗,*转基因植物疫苗：将编码病原生物有效蛋白抗原基因和高表达 的质粒一同植入到植物的基因中，产生的转基 因植物，食用后能产生免疫力 * 细胞因子基因工程疫苗：将某些细胞因子（如IL-2、4、IFN-r、 TNF等） 导入肿瘤细胞，诱发肿瘤抗原的递呈，活化肿瘤 特异性淋巴细胞，达到抗瘤目的,根据某些特定传染病的疫情监测和人群免疫状况分析，按规定的程序有计划地进行人群预防接种，达到控制和消灭传染病的目的，称计划免疫。,（四）、计划免疫,第二节、免疫治疗,免疫系统,免疫应答,免疫耐受,免疫防
